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- 2026年05月28日
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BestBio贝博
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500T/100T
贝博® BBcellProbe® 正常细胞/膜损伤细胞染色试剂盒是采用Calcein-AM/7-AAD双染细胞的方法染色活细胞和膜损伤细胞（死细胞）。 活细胞的特征是无处不在的细胞内酯酶活性，Calcein-AM是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，Calcein-AM由于在Calcein的基础上加强了疏水性，因此能够轻易穿透活细胞膜。当其进入到细胞质后，酯酶会将其水解为Calcein，聚阴离子染料Calcein很好地保留在活细胞内，几乎无荧光的Calcein-AM转变为绿色荧光的Calcein，在活细胞中发出均匀的强绿色荧光。 与其它同类试剂（如BCECF-AM和Carboxy-fluorescein diacetate）相比，Calcein-AM是最适合作为荧光探针去染活细胞的，因为它的细胞毒性很低，而且不会抑制任何的细胞功能，如增殖和淋巴球的趋化性。Calcein的激发和发射波长分别为490 nm和515 nm。Calcein -AM仅对活细胞染色。 7-AAD是一种非渗透性荧光染料，作为核染色染料的7-AAD不能穿过正常活细胞的细胞膜，但可穿透膜损伤细胞如晚期凋亡细胞或者坏死细胞的细胞膜，它穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的DNA上，形成具有高荧光性的加成物，从而产生红色荧光(激发：488，545nm，发射：647 nm)，因此7-AAD仅对膜损伤的死细胞染色。可以用来检测膜损伤的无活性的细胞。 由于Calcein和7-AAD-DNA都可被490 nm激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和膜损伤细胞。用545 nm激发，仅可观察到膜损伤细胞。 本染色方法适用于荧光显微镜、荧光酶标仪等微孔板荧光扫描设备、流式细胞仪或者其它的荧光设备。 本染色方法适用于大多数真核细胞，包括贴壁细胞和某些组织样本，单不包括细菌和酵母样本。 需要注意的是，Calcein-AM/7AAD双染有效染色的前提是相应的细胞模型的活力变化是酯酶活性变化和质膜完整性变化这些物理和生化特性，不影响这些细胞特性的细胞毒性事件可能不能使用此方法进行准确评估。
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文献和实验1. 染色工作液的配制：
根据样品数按下列比例配制染色工作液。
用稀释液将染料10倍稀释，再用相应的无血清培养基或其他缓冲液（如HBSS）进行50-100倍稀释，配制成染色工作液。。
2. 收集样本细胞，细胞数量在1X106个以内。
3. 用PBS洗涤细胞两次。
4. 用200 μl染色工作液将细胞重悬。
5. 4℃避光孵育15-30分钟。
6. 用PBS洗涤细胞。
7. 用适量PBS重悬细胞。
8. 用荧光显微镜或流式细胞仪检测结果。染料-DNA复合物的最大激发490±10nm，最大发射波长分别为515nm和647nm。
结果分析 ：
荧光显微镜下，使用490±10nm波长激发，活细胞为黄绿色，膜损伤细胞为红色。
用545 nm波长激发，能够看到红色的膜损伤细胞/死细胞。
1.所有细胞都染上红色？
7AAD浓度过高会导致活细胞也被染色，需要优化7AAD的使用浓度，稀释至仅对膜损伤细胞核染色，而不会对细胞质染色的最佳工作浓度。
2.细胞被同时染上绿色和红色？
样本中有大量晚期凋亡细胞时，细胞胞浆会有Calcein着色并呈碎片状，而且7AAD也为阳性。
胞内因子固定破膜剂 (即用型) K082R FcR封闭 Purified Anti-Mouse CD16/32 Antibody FNab30106 Purified Anti-Human CD16 Antibody FNab10997 死活染料 Calcein AM/PI活死细胞双染试剂盒 FNCK022 FineTest® Red 780(死活染料) K121 FineTest®
膜，依靠机械剪切促使膜囊泡破裂、重新组装包裹在纳米颗粒表面；优势：对膜蛋白损伤小，细胞膜完整性好，包裹质量高；缺点：通量低、人力成本高，适合实验室小试。 超声法（Sonication）：水浴超声，利用超声能量让膜囊泡破碎重构，包裹到纳米内核表面；快速简便，设备易得；缺点：超声能量容易破坏膜蛋白空间构象，丢失生物靶向功能；包裹均匀度不稳定。 微流控（Microfluidics，新兴规模化潜力技术）：两相流体精准混合，可控实现膜包裹；可自动化，是规模化 GMP 生产的潜力方向，但设备门槛高。 电穿
检测方法 Annexin V / PI 双染法（最经典、最常用） 这是目前应用最广泛的凋亡检测方法，主要基于细胞膜磷脂酰丝氨酸（PS）的外翻和细胞膜完整性的变化。 原理： Annexin V： 一种钙离子依赖性磷脂结合蛋白，能高亲和力地结合暴露在细胞膜外侧的PS（早期凋亡标志）。 PI（碘化丙啶）： 一种核酸染料，不能穿透完整的细胞膜，只能进入膜完整性受损的晚期凋亡或坏死细胞。 结果判读（四象限分析）： Annexin V⁻ / PI⁻： 活细胞。 Annexin V⁺ / PI⁻： 早期凋亡细胞（PS外翻，但膜
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