手机验证
询价列表
暂时没有已询价产品
微信扫一扫分享
分享到新浪微博
分享到丁香园论坛
蛋白实验---重组蛋白的Dot
【实验目的】
熟悉利用Dot-Western blot进行微量重组蛋白鉴定分析的原理和方法。
【实验原理】
微量重组蛋白(纯化或未纯化的)固定在硝酸纤维素(NC)膜上以后,用脱脂奶粉封闭NC膜上其他结合位点,利用兔抗重组蛋白的抗体(一抗)可特异与重组蛋白结合的特点,当NC膜与一抗溶液温育时,抗体可特异结合在重组蛋白上,当NC膜再与辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG的抗体(二抗兔)溶液温育时,则该抗体可特异的与一抗结合,将NC膜浸泡在含辣根过氧化物酶底物的溶液中,HRP与二氨基联苯胺(DAB)及H2O2反应生成褐色产物,沉淀于NC膜上重组蛋白所在部位,故可以检测目的蛋白的存在。
【器材与试剂】
1.实验仪器 微量移液器,脱色摇床
2.实验试剂 封闭液:5%脱脂奶粉,150 mmol/L NaCl, 20 mmol/L Tris-Cl,pH7.5;漂洗液:150 mmol/L,NaCl 20 mmol/L Tris-Cl,pH7.5;显色液:20 mmol/LTris-Cl,pH8.0,0.1% NiCl2 ,0.01% H2O2 ,0.01% 3,3’二氨基联苯胺(DAB)
3.实验材料 1 mg/mL重组牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶,1 mg/mL牛血清白蛋白,兔抗牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶抗血清,羊抗兔IgG的抗体
【实验步骤】
1.分别取重组牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶和牛血清白蛋白(阴性对照)溶液各2 µL点在NC膜上的两处,用铅笔标记。
2.将NC膜放在一个干净培养皿中,加入20 mL封闭液于脱色摇床上温育1 h。
3.加入10 μL兔抗牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶抗血清(按照抗体效价调整一抗加入量),混匀,继续摇动2 h。
4.弃封闭液, NC膜分别用10 mL漂洗液洗膜3次,每次10 min。
5.弃漂洗液,重新加入20 mL封闭液和10 μL HRP标记的羊抗兔IgG,混匀,于脱色摇床上温育1 h。
6.弃封闭液,NC膜分别用10 mL漂洗液洗膜3次,每次10 min。
7.将NC膜转移到一个干净培养皿,加入20 mL显色液显色,待斑点清晰后,弃显色液。
8.将NC膜浸于蒸馏水中终止反应。
【注意事项】
如果待检测的目的蛋白是牛奶中的某一组分,则不能使用脱脂奶粉作为封闭剂。
风险提示:丁香通仅作为第三方平台,为商家信息发布提供平台空间。用户咨询产品时请注意保护个人信息及财产安全,合理判断,谨慎选购商品,商家和用户对交易行为负责。对于医疗器械类产品,请先查证核实企业经营资质和医疗器械产品注册证情况。
马上登录 或注册,即可保存询价历史