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-20℃保存,避免反复冻融。
有效期1年
Animal Tissue Direct PCR Kit
大量
翌圣生物科技(上海)股份有限公司
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50T
类别 | 编号 | 组分 | 产品编号/规格 | 储存 | |
10180ES50(50T) | 10180ES70(200T) | ||||
Part I | 10180-A | Buffer AL | 5mL | 20mL | 室温或4℃ |
10180-B | Protease | 220μL | 880μL | 4℃ | |
10180-C | 6× DNA Loading Buffera | 375μL | 1.5mL | 4℃或-20℃ | |
Part II | 10180-D | 2× Tissue Master Mixb | 500μL | 2 × 1mL | -20℃ |
组分 | 体积(μL) | 体积(μL) | 终浓度 |
2× Tissue Master Mix | 10 | 25 | 1× |
Forward Primer (10μM) | 0.5 | 1 | 0.2-0.25μM |
Reverse Primer (10μM) | 0.5 | 1 | 0.2-0.25μM |
裂解产物(DNA模板) | 2 | 5 | - |
ddH2O | To 20 | To 50 | - |
循环步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
预变性 | 94℃ | 5min | 1 |
变性 | 94℃ | 10sec | 30-40 |
退火 | 50-65℃ | 20sec | |
延伸 | 72℃ | 30sec/kb | |
终延伸 | 72℃ | 5min | 1 |
常见问题 | 可能原因 | 解决方法 |
阳性对照、待测样本均无条带。 | PCR反应体系或反应条件不合适。 | 使用梯度PCR摸索PCR最佳反应条件。 |
PCR试剂保存不当失去活性。 | 2× PCR Mix应保存于-20℃,使用时避免反复冻融。若使用频繁,可在4℃短时间存放。 | |
引物设计问题。 | 尝试重新设计引物进行检查。 | |
阳性对照有目的条带,待测样本无条带或条带弱。 | 不当储存或长期储存引起试剂活性丧失。 | 使用新鲜的试剂。 |
加入组织裂解液过量。 | 增大反应体系,或减少裂解液的用量。 | |
样本裂解混合液保存不当或保存时间过久,DNA基因组已经降解。 | 裂解混合液液可在4℃保存2-3天,尽量使用新制备的裂解液混合液进行PCR。 | |
模板加入量不适合。 | 在反应体系10-20%范围内优化模板加入量。反应效性能较差时,可以降模板浓度调节到低于10%的范围。 | |
PCR循环数不足。 | 适当增加PCR的循环数,推荐在35-40循环为佳。因为模板复杂,一般PCR反应要比用纯化的 DNA模板多5-10个循环为佳。 | |
非特异性扩增 | PCR退火温度太低,循环数、引物浓度或模板浓度太高。 | 增加PCR退火温度,降低PCR循环数、引物浓度或模板浓度。 |
PCR引物错配。 | 重新设计PCR引物。 | |
配制PCR反应体系时温度太高或配制完成后放置时间太久。 | PCR反应体系的配制在低温下进行,配制完成后尽快进行PCR扩增反应。 | |
阴性对照出现目的条带 | 操作工具或试剂污染。 | 实验所有试剂或器材均应高压灭菌。操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。 |
样本间交叉污染。 | 每个取样器只对一个样本使用;或取完一个样本后,将取样器刃口浸入2%的NaClO溶液中,反复涮洗,然后用干净的纸巾擦干残液。 |
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