小鼠肿瘤坏死因子(TNF-α）ELISA 试剂盒

背景介绍：
TNF-α是一种单核因子，主要由单核细胞和巨噬细胞产生。小鼠的 TNF-α基因长约 2.78kb，由 4 个外显子和 3 个内含子组成。小鼠 TNF-α前体含 235 个氨基酸残基，信号肽 为 79 氨基酸残基。成熟的小鼠 TNF-α分子量为 17kDa，由 156 个氨基酸残基组成。鼠与人 的 TNF-a 有 79％氨基酸有同源性，TNF-α的生物学作用无明显的种属特异性。TNF-α的生 物学活性非常复杂，包括对造血、免疫和炎症的调节，对血管和凝血的影响及多种器官（肝、 心脏、骨、软骨、肌肉和其它组织）的作用
检测原理：
小鼠肿瘤坏死因子-a ELISA 试剂盒采用基于双抗体夹心法的酶联免疫吸附检测技术。将 抗小鼠 TNF-a 单克隆抗体包被在酶标板上；分别加入梯度稀释的标准品和预稀释的样本， 标准品和样本中的小鼠 TNF-a 会与酶标板上的包被抗体充分结合；洗板后加入生物素化抗 小鼠 TNF-a 抗体，该抗体会与板子上包被抗体捕获的标准品和样本中的小鼠 TNF-a 发生特 异性结合；洗板后加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的链霉亲和素，生物素与链霉亲和素会 发生高强度的非共价结合；洗板后加入显色剂底物 TMB，若反应孔中样品存在不同浓度的 小鼠 TNF-a，则 HRP 会使无色 TMB 变成不同深浅（正相关）的蓝色物质，加入终止液后反 应孔会变成黄色；最后，在λmax=450 nm（OD=450 nm）处测定反应孔样品吸光度（OD）， 样本中的小鼠 TNF-a 浓度与 OD 成正比，通过绘制标准曲线和四参数拟合软件便可计算出 样本中小鼠 TNF-a 的浓度。
原理图：

注意事项：※※※
1. 试剂盒应在有效期内使用，请不要使用过期的试剂。
2. 试剂盒未使用时应保存在 2-8℃冰箱，已复溶但未用完的标准品，请丢弃。
3. 试剂盒使用前请在室温恢复 30 min，且充分混匀试剂盒里的各种成份及制备的样品。
4. 在试验中标准品和样本建议作复孔检测，且加入试剂的顺序应保持一致。
5. 为避免交叉污染，请在试验中使用 1 次性试管，枪头，封板膜（※）及洁净塑料容器。.
6. 浓缩生物素化抗体和浓缩酶结合物的体积较少，在运输过程中微量液体会沾到管壁及瓶 盖上，使用前请离心处理（5-10 S 即可），使管壁上的液体集中在管底部，取用时，请 用移液器小心吹打几次。
7. 除了试剂盒中的浓缩洗涤液和终止液可以通用外，请不要使用其他来源试剂盒内含的 试剂代替本试剂盒中的某单个组分。
8. 为保证结果准确，每次检测均需做标准曲线。
安全提示：试剂盒中的终止液为酸性溶液，操作人员在使用时请带上手套并注意防护；在操 作过程中也要避免试剂接触皮肤和眼睛，如果不慎接触，请用大量清水清洗；检测血液样本 及其它体液样本时，请按国家生物实验室安全防护有关管理规定执行。
试剂盒组成及储存：


自备实验器材（不提供，可代购）
1． 酶标仪（主波长 450nm，参考波长 630nm）
2． 高精度移液器及一次性吸头：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl
3． 洗板机或洗瓶
4． 37℃孵育箱
5． 双蒸水，去离子水，量筒等
6． 稀释用聚丙烯试管
样本收集及储存： 1. 细胞培养上清： 将细胞培养基移至无菌离心管，在 4℃条件下 1000×g 离心 10 min,然后将上清等量分装 于小 EP 管并于-20℃下保存（24 小时内检测可放入 2-8℃储存），避免反复冻融。
2. 血清样本： 室温血液自然凝固 20 min 后，在 4℃条件下 1000×g 离心 10 min，然后将上清等量分装 于小 EP 管并于-20℃下保存（24 小时内检测可放入 2-8℃储存），保存过程中如有沉淀， 请再次离心，避免反复冻融。
3. 血浆样本： 将全血收集到含抗血凝剂的管中，根据标本的实际要求选择 EDTA，柠檬酸钠或肝素作 为抗凝剂，混合 20 min，在 4℃条件下 1000×g 离心 10 min，然后将上清等量分装于小 EP 管并于-20℃下保存（24 小时内检测可放入 2-8℃储存），避免反复冻融。
※注意：血清血浆样本避免使用溶血、高血脂样本，以免影响检测结果；如果样本中的靶标 物检测浓度高于标准品的最高值，请将样品做适当倍数稀释后检测，建议正式实验前做预实 验以确定稀释倍数。
试剂准备：
1. 试剂回温：首先在实验前 30 min 将试剂盒，待测样本放置于室温下，浓缩洗涤液如出现 结晶，请放入 37℃温浴直到结晶全部溶解。
2. 配制洗涤液：预先计算好稀释后的洗涤液使用体积，然后用双蒸水或去离子水将 20 倍 浓缩洗涤液稀释成 1 倍应用液，未用完的浓缩洗涤液放入 4℃冰箱保存。
3. 标准品梯度稀释：加入标准品/样本稀释液（SR1）1ml至冻干标准品中，静置15分钟待 其完全溶解后轻轻混匀(浓度为2000pg/ml)，然后按照以下浓度：2000、1000、 500、 250、 125、62.5、31.25、 0 pg/ml进行稀释。复溶过的标准品原液（2000pg/ml）未用完的应 废弃或根据需要按照一次用量分装，并将其贮存在-20～-80℃冰箱，具体如下图。

4. 生物素化抗体工作液：预先计算好试验所需用量，用检测稀释液（SR2）将100倍抗体浓 缩液稀释成1倍应用工作液（稀释前充分混匀），请在30分钟内加入到反应孔中。 生物素化抗体工作液具体稀释方法如下

5. 酶结合物工作液：按每次试验所需用量配制，用酶结合物稀释液（SR3）将40倍浓缩酶 结合物稀释成1倍应用工作液（稀释前离心），请在30分钟内使用。
酶结合物工作液具体稀释方法如下：

6. 洗涤方法：  自动洗板：甩尽酶标板孔中液体，在厚迭吸水纸上拍干，注入洗涤液为 300ul/ 孔,注与吸出间隔为 30 秒，洗板 5 次。  手工洗板：甩尽酶标板孔中液体，在厚迭吸水纸上拍干，用洗瓶加入洗涤液 300ul/孔，静止 30 秒后甩净酶标板孔中液体，在厚迭的吸水纸上拍干，洗板 5 次。
检测步骤：

结果判断： 1.用酶标仪 450 nm 波长测定 OD 值。选择双波长检测，参考波长为 630 nm。如不能进行 双波长检测，请用 450 nm 的 OD 测定值减去 630 nm 的 OD 测定值。 2.计算标准品、样品的平均 OD 值：每个标准品和标本的 OD 值应减去零孔的 OD 值 3.以标准品浓度为横坐标，吸光度OD值为纵坐标，用软件绘制标准曲线，样品中TNF-a含量 可通过对应OD值由标准曲线换算出相应的浓度。 4.若标本 OD 值高于标准曲线上限，应做适当稀释后重新检测，计算浓度时再乘以稀释倍数。
参数表征： 1. 数据及标准曲线



本图仅供参考，应以当次试验标准品绘制的标准曲线计算小鼠 TNF-a 的样本含量 2. 灵敏度： 最低可检测小鼠 TNF-a 浓度达 15pg/ml， 20 个零标准品浓度 OD 的平均值加上两个标准差，计算相应的可检测浓度。 3. 特异性： 不与小鼠G-CSF 、GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、3、5、6、7、9等反应，人的TNF-α、TNF sRI、 TNF sRII等反应 4. 重复性： 板内，板间变异系数<10% 5. 回收率： 在选取的健康小鼠血浆、细胞培养上清中加入 3 个不同浓度水平的小鼠 TNF-a，计算回收 率。

6. 线性稀释： 分别在选取的 4 份健康小鼠血浆和细胞培养上清中加入高浓度小鼠 TNF-a，在标准曲线动 力学范围内进行稀释，评估线性。