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- 2025年11月21日
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合肥博美
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文献和实验显色（HRP酶） 1．增强化学发光法(ECL) Ecl 显色原理：氨基苯二酰肼类主要是鲁米诺及异鲁米诺衍生物，是最常用的一类化学发光剂。鲁米诺（luminol，5＇-氨基-2，3-二氢-1，4-酞嗪二酮）的分子结构及化学反应式如下： 鲁米诺在免疫测定中既可用作标记物，也可用作过氧化物酶的底物。在Ecl底物中，含有H2O2和鲁米诺，在HRP（辣根过氧化物酶）的作用下，发出荧光来。 试验步骤： 1）将两种显色底物1：1等体积混合（一般各1ml/membrane）。
在目前的以HRP作为标记酶的商品ELISA试剂盒中，如以TMB为底物，则提供的底物为A和B两瓶应用液；如以OPD为底物，则试剂盒提供OPD片剂或粉剂，临用前配制。一般商品试剂盒显色反应条件为37℃或室温反应15~30min。从理论上说，37℃30min才可以使HRP的底物催化反应完全，尽管在最初的10min内，绝大部分催化反应即可完成。因此，为使弱阳性样本孔能有充分的显色，建议在37℃下反应25~30min后，终止反应比色测定。此外，在加入底物开始显色反应前，最好是先检查一下底物溶液的有效
以及人IgGFc段的自身抗体，多数为IgM类，能充当抗原成分与固相及酶标抗体反应，从而呈现非特异性显色。 黄疸血标本中常含有内源性过氧化物酶，如用辣根过氧化物酶为标记物，就有可能产生非特异性显色。 2、外源性干扰物，常常因样品采集、贮存、处理不当造成如样品溶血，被细菌污染，标本凝集不全等。溶血标本，红细胞溶解破裂，释放出血红素形成，而血红素中的铁卟啉是过氧化物酶的类似物，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP（辣根过氧化酶）[2]，有国内报道
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