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2年
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pESC-Trp
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100
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kelei-bio
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20μl
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文献和实验1. 阳性克隆的筛选 （1）随机选取50个阳性克隆，扩增、抽提酵母质粒，电转化E.coliKC8宿主菌，抽提大肠杆菌中的质粒，酶切鉴定是否具有插入片段及排除相同的文库质粒。 （2）如果重复的插入序列较多，可另取50个阳性克隆来分析。最后得到数种片段大小不同的插入序列，再转化新的宿主细胞，检测是否仍为阳性克隆。2. 用质粒自然分选法(Natural Segregation)筛除只含有AD-文库杂合子的克隆 （1）将初步得到的阳性克隆接种SD/-Trp/-Ura液体培养基，培养
组成的LexA蛋白)与目标蛋白(钓饵，Bait)的融合蛋白，该融合体的表达受酵母强启动子ADH1的调控，选择与报告基因的操纵子LexA×8结合。 质粒pB42AD的筛选标志为TRP1，在其供外源基因插入的多克隆位点(EcoR I与Xho I)上游，含有SV40核定位(SV40 nuclear localization)、HA(血凝素)及AD(来自于E.coli 的88个氨基酸残基组成的B42蛋白)等几种编码序列，共同组成可以启动报告基因转录表达的激活成份。 在酵母EGY48的基因
μl +180μl NaCl(0.9％) 1:100000 1:1000; 1:10000；1:100000 三种浓度各取100μl 涂布SD/-Trp/-Leu 平板 20) 转库效率的计算：对生长在SD/-Trp/-Leu 平板上的克隆计数，挑选克隆数在 30-300 之间稀释度计算转库效率 转库效率计算实例： .. 在1：10000 转库效率计数平板上长出100 个克隆(稀释度=0.0001) .. 总悬浮体积= 5ml .. 文库质粒用量=100μg 转库
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