pTRE3G载体

【原创】关于In－Fusion cloning的使用心得

内切酶，为了考虑后期实验的方便性，通常会选择一个酶切效率高的酶比如说BamH1 EcoR1，另一个效率相对较低的，比如说Not 1， Kpn1。这四种我都用过，如果buffer不一样的，可以先切效率低的再切效率高的，中间切胶纯化。当然酶切效率跟载体本身结构也有关系，我用过的载体有pGBKT7，pGADT7，pEF4VH，pSeqTaq，Prolabel，pAcGFP，pTRE。其中pTRE没有成功过。2 插入片段的处理 使用高保真的酶扩增插入片段，我用过TaKaRa的primesSTAR GXL DNA

手把手教你做好体外 DNA 重组

克隆载体 pRCII 转入大肠杆菌为例。TA 克隆载体 pRCII 含有 LacZ 基因，多克隆酶切位点位于其间，当没有外源基因插入 LacZ 基因中时，LacZ 基因的启动子可使此基因编码半乳糖苷酶，从而催化底物 X-gal 发生化学反应，菌落变成蓝色；当外源基因与 pRCII 载体发生连接时，LacZ 基因失活，菌落呈白色；同时该质粒还含有氨苄青霉素耐药基因。根据此特性，白色菌落含有重组质粒。在用这种质粒进行克隆时，转化平板培养基中要加入 0.5 mM IPTG、50 g/mL 氨

RNAi技术专题之：体外转录合成双链RNA

突变和化学修饰的耐受性，认为siRNA的5’端相对于3’端具有对突变的较高耐受性。有学者认为正义链3’突出端的任何碱基修饰对siRNA作用效果均无明显影响。还有学者认为与反义链互补的正义链3’端发生1—4个碱基的错配反而有助于增强RNAI的活性。二、siRNA制备方法目前为止较为常用的5种制备siRNAs的方法包括化学合成体外转录长片断dsRNAs经RNase III 类降解 (e.g. Dicer, E. coli, RNase III)siRNA表达载体或者病毒载体在细胞中表达siRNAsPCR制备