pSAG1::CAS9-U6::sgUPRT载体

AAV 在心脏研究中的应用策略

-mediated liver detargeting enhances the tissue specificity of cardiac genome editing」的研究成果。该研究基于 Cre-LoxP、CRISPR/Cas9 等超敏 DNA 记录技术， 发现 AAV9-Tnnt2 载体在肝脏中广泛泄漏表达。利用 microRNA-122 在肝脏组织中高度特异性表达的特点，该团队在 AAV9-Tnnt2 转基因的 3'-UTR 引入4个串联的 miR122 靶序列(4×miR122TS)，利用肝脏中

5 分钟学会 cas9 基因敲除——原来设计方案如此简单

继续寻找合适成对 sgRNA 序列。04 根据找到的合适的 sgRNA 订购 oligo图为 U6 真核表达载体设计，Forward oligo:5'-ACGG, Reverse oligo:5'-AAAC。05 关于 cas9 的几个注意事项1）CRISPR-cas9 最主要的要求：PAM 序列为 NGG。2）sgRNA，即 cas9  guide  RNA，是引导 cas9 蛋白在基因编辑位点进行定向切割，所以一般是 20 个碱基，不含 PAM 序列。3）设计的 sgRNA 一定有效吗？一般设计

CRISPR-Cas9 全程实操教程：从 gRNA 设计到挑单克隆全程指导

的原件与表达 Cas9 的原件相连接，得到可以同时表达两者的质粒，将其转染细胞，便能够对目的基因进行基因操作，在 PAM (5'-NGG) 上游～3bp 进行切割，如下图所示。因此本实验的关键步骤是设计一对 20bp（不包括 NGG 在内的）完全互补的 oligo 插入到如上图所示的 filler。另 U6 启动子需要 5' 端的 G 起始转录，因此若设计的 oligo 第一个碱基非 G，需额外增加一个 G。操作详细流程1. 设计 sgRNA关于 sgRNA 的设计我们有专门开过一篇文章《一文掌握