γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶测定试剂盒（微量定磷法）

背景资料：
谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-glutamylcysteine synthetase，γ-GCS)，是谷胱甘肽(GSH)合成过程中的限速酶。细胞内γ-GCS活性升高使GSH合成加速，从而提高细胞内外GSH的浓度。GSH是机体一种重要的抗氧化剂，在保持气道上皮细胞完整性、抵御肺部损伤与炎症和抗氧化损伤等方面起到重要的作用，肺脏具有较高浓度的γ-GCS酶活及GSH浓度(6.1～17.5nmol/mg肺组织)，呼吸道上皮内衬液中GSH的浓度(200～400μmol/L)是血浆中的100倍。所以GSH在呼吸道炎症及过敏反应中起了非常重要的作用，并且对心血管疾病及肿瘤的治疗、予后有很大研究价值。

测定原理：
谷氨酸和半胱氨酸在γ-GCS催化作用下，消耗ATP，反应生成γ-谷氨酰半胱氨酸、无机磷和ADP，在636nm下，通过显色反应测定体系中无机磷的量可判断γ-GCS活力的高低。

产品优点：

• 快速简便：全程约2小时，可测50例左右样本。


• 稳定性好：试剂盒2～8℃存放6个月有效。


• 再现性好：变异系数CV=1.7%。


• 回收试验：X =103%。


• 受外界影响因素小：干扰因素少，重复性强。


• 测试面广：可测动物血清（浆）、组织等。

产品组成：

组分		规格	保存
试剂一：缓冲液		25mL	4℃
试剂二：基质液		25mL	4℃
试剂三：促进剂	粉剂	3支	4℃
	溶剂	10mL	4℃
试剂四：终止剂		6mL	室温
试剂五：显色剂	甲液	8×7mL	4℃
	乙液	8×6mL	4℃
试剂六：稳定剂		100mL	室温
10μmol/mL标准磷储备液		5mL	4℃避光

试剂配制：

• 促进剂工作液：
  临用前每支试剂三粉剂加试剂三溶剂1.8mL溶解。


• 显色剂工作液：
  用时取一瓶试剂五甲液加入一瓶试剂五乙液中，充分混匀，足够13个管子的用量，如果样本量较少，可以按试剂五甲液:试剂五乙液＝7:6的比例配制。显色剂工作液4℃可保存五天，注意避免磷污染。


• 基质缓冲液：
  按试剂一:试剂二＝1:1的比例配制，现配现用，配制完成后1～2小时内稳定。


• 0.1μmol/mL标准磷工作液：
  用时将10μmol/mL标准磷储备液用双蒸水100倍稀释，例如取0.1mL的10μmol/mL标准磷储备液加入双蒸水至10mL。


• 0.02μmol/mL标准磷工作液：
  用时将0.1μmol/mL标准磷工作液用双蒸水5倍稀释，例如取1mL的0.1μmol/mL标准磷工作液加入双蒸水4mL。

操作步骤：

成分	空白管	标准管	测定管	对照管
基质缓冲液(μL)			250	250
促进剂工作液(μL)			25	25
样本(μL)			25
37℃水浴1个小时
终止剂(μL)			25	25
样本(μL)				25
双蒸水(μL)	325
0.02μmol/mL标准磷工作液(μL)		325
显色剂工作液(mL)	1	1	1	1
充分混匀，室温静置2分钟
稳定剂(mL)	1	1	1	1
充分混匀，室温静置5分钟后，636nm，1cm光径双蒸水调零比色。

实验结果：

• 单位定义
  把每小时每毫克组织蛋白的组织中ATP酶分解ATP产生1μmol无机磷所需的酶量定义为一个ATP酶活力单位。即微摩尔磷/毫克蛋白/小时(μmolPi/mgprot/hour)。


• 计算公式

  γ-GCS活力 (U/mgprot)	＝	OD测定－OD对照	×	标准品浓度 (0.02μmol/mL)	×	60分钟	×13÷	待测样本蛋白浓度 (mgprot/mL)
  		OD标准－OD空白				6分钟



• 计算举例
  取新鲜小鼠小肠组织用生理盐水按重量(g):体积(mL)＝1:9的比例，制备成10%匀浆，离心取上清稀释成1%的浓度，按步骤操作检测，测得空白OD值为0.045，标准OD值为0264，测定OD值为0.801，对照OD值为0.423，同时测得1%匀浆蛋白含量为0.503g/L，则计算结果为

  γ-GCS活力 (U/mgprot)	＝	0.801－0.423	×0.02×10×13÷0.503＝8.92U/mgprot
  		0.264－0.045

附录：磷标准曲线的制备

• 试剂准备
  将10μmol/mL标准磷储备液用双蒸水稀释成梯度浓度磷标准液：0.005、0.01、0.02、0.04、0.05、0.06、0.08、0.1μmol/mL。


• 操作表：

  成分	空白管	标准管
  双蒸水	325μL
  梯度浓度磷标准液		各325μL
  显色剂工作	1mL	1mL
  充分混匀，室温静置2分钟
  稳定剂	1mL	1mL
  充分混匀，室温静置5分钟后，636nm，1cm光径双蒸水调零比色。



• 测定结果

  磷标准液浓度(μmol/mL)	测定OD值	绝对OD值
  0.000	0.050	0.000
  0.005	0.093	0.043
  0.010	0.152	0.102
  0.020	0.270	0.220
  0.040	0.499	0.449
  0.050	0.624	0.574
  0.060	0.741	0.691
  0.080	0.964	0.914
  0.100	1.201	1.151



• 绘制标准曲线