DN07-组织/细胞基因组DNA快速提取试剂盒

♦ 适用范围： 适用于快速提取各种动植物细胞组织基因组 DNA

本试剂盒在室温储存 12 个月不影响使用效果

1. 结合液 CB 或者抑制剂去除液 IR 低温时可能出现析出和沉淀，可以在 37℃水浴几分钟帮助重新溶解，恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。
2. 蛋白酶 K 保存在即用型甘油缓冲液中，常温运输。收到后，不超过 25℃室温至少保存 6 个月，4℃保存 12 个月，-20℃保存 2 年。
3. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH 值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

1. 离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
2. 不需要使用有毒的phenol等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。
3. 快速，简捷，单个样品操作一般可在 30 分钟内完成。
4. 多次柱漂洗确保高纯度，OD₂₆₀/OD₂₈₀典型的比值达 1.7～1.9，长度可达 30kb-50kb，可直接用于 PCR、Southern-blot 和各种酶切反应。

♦ 注意事项

1. 所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到 13,000rpm 的传统台式离心机，如 Eppendorf 5415C 或者类似离心机。
2. 需要自备 1×PBS (磷酸盐缓冲液) 和异丙醇。
3. 实验前将需要的水浴预先热到 70℃备用。
4. 结合液 CB 和抑制剂去除液 IR 中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤、眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
5. 洗脱液 EB 不含有螯合剂 EDTA，不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱，但应该确保 pH 大于 7.5，pH 过低影响洗脱效率。用水洗脱 DNA 应该保存在 - 20℃。DNA 如果需要长期保存，可以用 TE 缓冲液洗脱 (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0)，但是 EDTA 可能影响下游酶切反应，使用时可以适当稀释。

♦ 关于平衡液的使用

1. 介绍：核酸吸附硅胶膜柱子长期放置过程中会同空气中的电荷 / 尘埃发生反应而影响其核酸的结合能力。硅胶柱经平衡液预处理后可大大减少柱子中硅胶膜的憎水基团，提高核酸的结合能力，从而提高硅胶柱子回收效率或者产量。平衡液是强碱性溶液，若不小心碰到，请用大量自来水清洗。用完后盖紧聚四氟盖，以免接触空气。室温保存。在保存过程中可能有沉淀生成，请加热至 37℃使沉淀完全消失。
2. 使用方法：取一个新的硅胶膜吸附柱子装在收集管中，吸取 100μl 的平衡液至柱子中。13000 rpm 离心 1 分钟，倒掉收集管中废液，将吸附柱子重新放回收集管。此时平衡液预处理柱子完毕。接后续的操作步骤。

♦ 操作步骤:（实验前请先阅读注意事项）

1. 组织培养细胞

    

   a. 收集约 10⁵-10⁶悬浮细胞到一个 1.5ml 离心管；对于贴壁细胞，应该先用胰蛋白酶消化后吹打下来收集。

    

   b. 13,000rpm 离心 10 秒，使细胞沉淀下来。弃上清，留下细胞团和大约 10-20μl 残留的液体。

    

   c. 加 200μl 1×PBS 重悬洗涤细胞，13,000rpm 离心 10 秒，使细胞沉淀下来。完全吸弃上清，将细胞沉淀重悬于 180μl 1×PBS 中。

    

   d. 加入 20μl 蛋白酶 K (20mg/ml) 溶液，充分混匀，再加入 200μl 结合液 CB，立刻涡旋振荡充分混匀，在 70℃放置 10 分钟。

    

   可选步骤：如果 RNA 残留较多，需要去除 RNA，可以在加入 200μl 结合液 CB 前加 20μl RNase A (25mg/ml) 溶液，振荡混匀，室温放置 5-10 分钟。

    

   e. 冷却后加 100μl 异丙醇，立刻涡旋振荡充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。

    

   f. 将上一步混合物（包括可能有的沉淀）加入一个吸附柱 AC 中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm 离心 60 秒，倒掉收集管中的废液。

    

   g. 按操作步骤项 4。
2. 动植物组织（例如肝胰腺或者植物叶片）

    

   a. 新鲜或者解冻的组织在液氮中研磨成细粉后或者用解剖刀切成小碎块（切成微块可以提高产量）后取 20-50mg，转入装有 180μl 组织裂解液 TL 的 1.5ml 离心管中，用大口径枪头吹打混匀。

    

   b. 加入 20μl 的蛋白酶 K 溶液 (20mg/ml)，立刻涡旋振荡充分混匀。

    

   c. 将裂解物放置在 56℃水浴 1-3 小时或者直到组织消化完全，期间轻柔的振荡几次帮助裂解。

    

   可选步骤：如果 RNA 残留较多，需要去除 RNA，可在完成步骤 c 后加 20μl RNase A (25mg/ml) 溶液，振荡混匀，室温放置 5-10 分钟。

    

   d. 加入 200μl 结合液 CB，立刻涡旋振荡充分混匀，70℃放置 10 分钟。

    

   e. 冷却后加 100μl 异丙醇，立刻涡旋振荡充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。

    

   f. 用 1ml 的枪头吸取混合物，将混合物加入一个吸附柱 AC 中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm 离心 60 秒，倒掉收集管中的废液。

    

   如果有不溶组织物可能堵住枪头，可将枪头在吸水纸上轻蹭去除不溶物；如果吸上来的混合物少则可以将枪头和不溶物一起弃去，该做法是为了去除不溶物，以免堵塞离心柱。

    

   g. 按操作步骤项 4。
3. 动植物组织（鼠尾）

    

   a. 将 0.2-0.5cm 的鼠尾巴尖（即 20-50mg）剪碎（一定要剪 0-2cm 范围内的尾巴尖，否则裂解效果不好），或者在液氮中研磨组织成细粉后，转入装有 180μl 组织裂解液 TL 的 1.5ml 离心管中，用大口径枪头吹打混匀。

    

   b. 加入 20μl 的蛋白酶 K (20mg/ml)，立刻涡旋振荡充分混匀。

    

   c. 将裂解物放置在 56℃水浴 3 小时或者直到组织消化完全，期间轻柔的振荡几次帮助裂解。

    

   可选步骤：如果 RNA 残留较多，需要去除 RNA，可在完成步骤 c 后加 20μl RNase A (25mg/ml) 溶液，振荡混匀，室温放置 5-10 分钟。

    

   d. 用一个 1ml 不带针头的一次性输液器抽打裂解物 2-3 次。

    

   e. 加入 200μl 结合液 CB 和 100μl 异丙醇，立刻涡旋振荡充分混匀。

    

   f. 13,000rpm 离心 5 分钟，将上清加入一个吸附柱 AC 中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm 离心 30-60 秒，倒掉收集管中的废液。

    

   g. 按操作步骤项 4。

    

   上述步骤中立刻涡旋或者充分充分混匀非常重要，混匀不充分严重降低产量，必要时如样品粘稠不易混匀时可以涡旋振荡 15 秒混匀。
4. 加入 500μl 抑制剂去除液 IR，12,000rpm 离心 30 秒，弃废液。
5. 加入 600μl 漂洗液 WB（请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm 离心 30 秒，弃掉废液。
6. 加入 600μl 漂洗液 WB，12,000rpm 离心 30 秒，弃掉废液。
7. 将吸附柱 AC 放回空收集管中，13,000rpm 离心 2 分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
8. 取出吸附柱 AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加 100μl 洗脱缓冲液 EB（洗脱缓冲液事先在 65-70℃水浴中预热效果更好），室温放置 3-5 分钟，12,000rpm 离心 1 分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置 2 分钟，12,000rpm 离心 1 分钟。

    

   洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要 DNA 浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是最小体积不应少于 50μl，体积过小降低 DNA 洗脱效率，减少 DNA 产量。
9. DNA 可以存放在 2-8℃，如果要长时间存放，可以放置在 - 20℃。