PL12-高纯度质粒大量快速提取试剂盒（离心柱型）
本试剂盒在室温储存 12 个月不影响使用效果。
储存事项：
- RNase A 保存在即用型甘油缓冲液中，常温运输，收到后，不超过 25℃室温至少保存 6 个月，4℃保存 12 个月，长期保存放 - 20℃。
- 第一次使用时，可将试剂盒所带全部的 RNase A 加入溶液 P1 后（终浓度 100μg/ml）置于 4℃可保存 3 个月左右。如果溶液 P1 中 RNase A 时间较久失活了，提取的质粒可能有微量 RNA 残留，在溶液 P1 中补加 RNase A 即可。
- 环境温度低时溶液 P2 中 SDS 可能会析出，出现浑浊或者沉淀，可在 37℃水浴加热几分钟即可恢复澄清，重新混匀，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。
本试剂盒采用改进 SDS - 碱裂解法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低 pH 值状态下选择性地结合溶液中的质粒 DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分如内毒素去除，最后低盐、高 pH 值的洗脱缓冲液将纯净质粒 DNA 从硅基质膜上洗脱。提取的质粒纯度很高，并去除了大部分内毒素，除用于常规的 PCR，酶切，转化等实验外，还可以直接用于原生质体转染等一般的转染实验。特别要求高的细胞系转染可选择艾莱的 PL13 - 无内毒素质粒大量提取试剂盒。
- 离心吸附柱内硅基质膜全部采用特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
- 独有的去蛋白液配方，可以高效去除残留的核酸酶，即使是核酸酶含量丰富的菌株如 JM 系列、HB101 也可以轻松去除。有效防止了质粒被核酸酶降解。
- 不需要使用有毒的phenol，氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀。快速，方便，从 150-300ml 大肠杆菌 LB (Luria-Bertani) 培养液中，可快速提取 0.5-2mg 纯净的高拷贝质粒 DNA，提取率达 80-90%。
- 获得的质粒产量高、超螺旋比例高、纯度好，可以直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序、原生质体转染等各种分子生物学实验。
- 所有的离心步骤如未加另外说明均在室温完成，使用转速可以达到 8,000×g（约 9,000rpm），带 50ml 转头的台式离心机。
- 提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于 10Kb 的大质粒，应加大菌体使用量，同时按比例增加 P1、P2、N3 的用量，洗脱缓冲液应在 70℃预热。可以适当的延长吸附和洗脱的时间，以增加提取效率。
- 得到的质粒 DNA 可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD260 值为 1 相当于大约 50μg/mL DNA。电泳可能为单一条带，也可能为 2 条或者多条 DNA 条带，这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成，与提取前培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。本公司产品正常操作情况下基本超螺旋可以超过 90%。
- 质粒 DNA 确切分子大小，必须酶切线性化后，对比 DNA 分子量 Marker 才可以知道，处于环状或者超螺旋状态的质粒，泳动位置不确定，无法通过电泳知道其确切大小。
➤第一次使用前请先在漂洗液 WB 瓶和去蛋白液 PE 瓶中按标签指示加入无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入！
➤将 RNase A 全部加入溶液 P1 中，混匀。每次使用后置于 2-8℃保存。
- 取 150-200ml（最多不超过 300ml）过夜培养的菌液加入 50ml 离心管，8,000×g（约 9,000rpm），离心 1min，尽可能的倒干上清，收集菌体。
▲ 如使用 50ml 离心管，可以离心弃上清后，在同一个 50ml 管内加入更多的菌液，重复步骤 1，直到收集到足够的菌体。
- 加 7.5ml 溶液 P1 重悬菌体沉淀，移液器吹打或者涡旋振荡至彻底悬浮。
▲ 如果有未彻底重悬的菌体块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。
- 加 7.5ml 的溶液 P2，温和地上下翻转 6-8 次使菌体充分裂解，室温放置 4-5min。
▲ 温和地混合，不要剧烈震荡，以免基因组 DNA 剪切断裂！所用时间不应超过 5min！以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠。如果很浑浊，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。
- 加 7.5ml 溶液 N3，立即温和地上下翻转 6-8 次，充分混匀此时会出现白色絮状沉淀。8,000×g 离心 10min，小心吸取上清至新管，避免吸取到漂浮的白色沉淀。
▲ 加入溶液 N3 后应该立即混匀，以免产生 SDS 的局部沉淀。
▲ 如有漂浮白色沉淀，可用吸头撇开浮沫伸入液面下吸取，偶然吸到少量漂浮的白色沉淀也不影响实验结果，后续过滤漂洗过程中都会去除。
- 向上一步得到的上清中加入 0.5 倍体积异丙醇（约 10ml）后充分颠倒混匀后，分多次转移混合液至吸附柱 DC 中，8,000×g 离心 1min，弃滤液。
▲个别情况下离心机转子倾角较大，建议每次加入吸附柱的溶液体积为 10ml（不超过，以防产生漏液现象）。直到所有混合溶液通过此吸附柱。
- 加入 10ml 去蛋白液 PE（请先检查是否已加入无水乙醇！），8,000×g 离心 1min，弃滤液。
- 加入 10ml 漂洗液 WB（请先检查是否已加入无水乙醇！），8,000×g 离心 1min，弃滤液。再加入 10ml 漂洗液 WB，重复漂洗一次，弃滤液。
- 将空吸附柱放回收集管中，8,000×g 离心 3min 以干燥基质膜上残留乙醇。
▲该步骤为去除吸附柱中残留乙醇，残留乙醇抑制下游反应并降低洗脱效率，降低质粒产量。
- 将吸附柱置于新的 50ml 离心管中，室温晾干 2-3min，在吸附膜的中间部位加 1ml-2ml 洗脱缓冲液 EB（洗脱缓冲液事先在 65-75℃水浴中预热可提高产量），室温放置 2min，8,000×g 离心 1min，弃吸附柱。
▲ 推荐：为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置 1min，8,000×g 离心 1min。洗脱两遍可提高浓度约 10%。
▲ 洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要质粒浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是需注意体积过小降低质粒洗脱效率，减少质粒产量（最小不应少于 1ml）。
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文献和实验
