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- 北京
- 2025年07月15日
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99
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北京诺博莱德科技有限公司
HiPure Yeast Plasmid Mini Kit
酵母高纯度质粒大量快速提试剂盒
目录号：31119-10
产品内容：
|
产品组成 |
保存 |
10 次 |
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溶液YP1 |
室温 |
75 ml |
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溶液YP2 |
室温 |
75 ml |
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溶液YP3 |
室温 |
100 ml |
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去蛋白液 PD |
室温 |
63 ml |
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漂洗液 WB |
室温 |
50 ml |
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洗脱缓冲液 EB |
室温 |
20 ml |
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RNase A (10 mg/ml) |
-20℃ |
750 ul |
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Lyticase |
-20℃ |
1 g |
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50ml 吸附柱和收集管 |
室温 |
10 套 |
保存条件：
在室温(15 ~ 25℃)干燥条件下，可保存 12 个月。加入 RNase A 后的溶液 P1 应置于 2 ~ 8℃
保存，可稳定保存 6 个月,如果 P1 中 RNase A 失活，重新补加即可。
产品简介：
本试剂盒用于高纯度酵母质粒 DNA 的小量制备。菌体经碱裂解、高盐、低 pH 处理，质粒可从菌体中释放出来，并特异、高效地被离心吸附柱吸附。通过清洗液的洗涤可去除杂质，在低盐、高 pH 条件下洗脱，最后得到纯度较高的质粒 DNA。所得质粒可直接用于酶切、转化、PCR、RT-qPCR、测序及转染等分子生物学实验。
注意事项：
1. 通常酵母的拷贝数都很低，高拷贝最大得率一般为每 5 ml 培养物提取 1 μg 左右的质粒。用于下游试验时通常建议使用量为：1-5 μl 用做 PCR 模板;5-10 μl 用于转化大肠杆菌,选择高效率的感受态细胞。
2. 用户需要自备 Sorbitol buffer( 1M 山梨醇， 0.1M Na2EDTA，14 mM β-巯基乙醇)。 配制方法：在 600 ml 去离子水里面溶解 182.2 克山梨醇，加入 200 ml 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0) ，不需要调节 PH 值，定容到 1L，4℃保存。临用前加 0.1%β-巯基乙醇(商品化的 β-巯基乙醇摩尔浓度一般为 14M)。
3. 使用前请先检查平衡液、溶液 YP2 和溶液 YP3 是否出现浑浊，如有混浊现象，可在 37℃
水浴中加热几分钟，即可恢复澄清。
4. 溶液YP1，YP2 和YP3 的用量比例，若细菌量增大，需按比例放大这些溶液的使用量；
重要提示：
一、第一次使用前请先在去蛋白液 PD、漂洗液 WB 中加入指定量无水乙醇（见瓶身标签），充分混匀，并做好标记，以免多次加入。
二、首次使用时请先将 RNase A 全部加到溶液YP1 中，混匀，每次使用后置于 2 ~ 8℃保存。三、吸取使用量的Sorbitol buffer 加入 0.1%β-巯基乙醇，回复到室温备用。
操作步骤：
1. 取 100 - 180 ml 酵母培养物，12,000 x g 离心 1 min，尽可能的吸弃上清，收集菌体。
（注意： 如果用 50ml 离心管收集菌体，可以离心弃上清后，在同一管内加入更多的菌液，重复步骤
1，直到收集到足够多的菌体）
2. 加入 10 ml Sorbitol buffer，轻柔吹打充分重悬细胞；加入 0.1 g Lyticase (Lyticase 临用前用 2ml Sorbitol buffer 溶解)，充分颠倒混匀，37℃温育 1 – 2 小时消化细胞壁，中间可颠倒数次帮助消化。
（注意：如果破壁效果不好导致质粒产量低，可以加大 lyicase 用量来提高酶工作浓度，还可以延长消化时间来提高效果，不适合 Lyticase 消化的酵母可选用 Zymolase 或者其它方法如玻璃珠涡旋，反复冻融等。）
3. 12,000 x g 离心 2 min，尽可能吸弃上清，加入 7 ml 溶液YP1，重悬菌体沉淀，涡旋震
荡至彻底悬浮。
（注意：如有未彻底悬浮的菌块会影响裂解，导致提取的质粒浓度及纯度降低）
4. 加入 7 ml 溶液YP2，温和地上下翻转 6-8 次，使菌体充分裂解，室温放置 4 min。
（注意：不可剧烈震荡，以免造成基因组 DNA 片段的污染，所用时间不要超过 5 min，以免质粒受到破坏，如未完全变得清亮，可能是菌体太多，可增加溶液 P2 的用量，在后续的操作中溶液 YP3 的用量也要相应增加）
5. 加入 10 ml 溶液YP3，立即温和地上下翻转 6-8 次，充分混匀时会出现白色絮状沉淀，
然后室温 12,000 x g 离心 10 -15 min, 小心取上清，避免吸到白色漂浮物。
（注意：加入溶液 YP3 后应立即混合，避免产生 SDS 的局部沉淀,如果上清中还有白色漂浮物，可再次离心取上清）
6. 将上清液加入吸附柱中（吸附柱最大容量 10ml），室温 12,000 rpm 离心 1 min，质粒被
吸附在膜上，弃滤液。重复步骤直到上清全部被加入吸附柱。
7. 可选步骤：向吸附柱中加入 10 ml 去蛋白液 PD，室温 12,000 x g 离心 1 min，弃滤液。
8. 加入 10 ml 漂洗液 WB，室温 12,000 x g 离心 1 min，弃滤液。
（注意：漂洗液 WB 为浓缩液，按要求加入无水乙醇，用后应立即盖紧瓶盖，以防酒精挥发）
9. 重复步骤 8 一次。
10. 室温 12,000 x g 离心 2 min，甩干膜上残留乙醇。打开盖子室温晾干 2 – 3 min。
（注意：此步不能省略，否则残留乙醇会影响质粒的后续使用）
11. 将吸附柱置于一个新的 50 ml 离心管（自备）中，加入 0.6 - 1ml 的洗脱缓冲液EB，室温放置 2 min，12,000 rpm 离心 2 min，离心管底溶液即质粒 DNA。
（注意：事先在 65~70℃水浴中预热洗脱缓冲液 EB，可增加洗脱效率；如果需要较多量质粒，可将得到的溶液重新加入吸附柱中，再次离心 1 min 收集；如需使用去离子水洗脱，可用 NaOH 调整其 pH值在 7.0 - 8.5 之间。）
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文献和实验/RealTime PCR扩增的技术进步，很多样品的需求量大大减少，几百个纳克到几个微克足够，而最常见的离心柱型小量提取，正好可以提取几个微克到十几微克的样品。完全可以满足下游试验的需要。 2. 离心柱操作不使用苯酚，氯仿有毒害物质。方便快捷，裂解后配合蛋白酶K消化，过柱子，漂洗，洗脱，几个简单步骤就可以完成全部过程。适合于标准化高通量操作，对操作技巧要求低，即使初学者提取也可以得到稳定的结果。 3. 联合的蛋白酶K消化，和漂洗，可以确保了高纯度的可能性。是目前所有方法中，纯度最高的一种全血
的磁珠纯化方案正在逐步替代以往的各种方法，特别是目前普遍应用的离心柱法。 酚法抽提、玻璃珠沉淀法、离心柱法与磁珠法： 经典的核酸纯化法采用酚、氯仿抽提，样品经过处理后分为水相和有机相，通过酒精离心沉淀水相中核酸的方法纯化样品中的核酸，这就是我们所说的酚-率氯仿抽提法。酚法抽提相对稳定，至今仍被多数科技工作者广泛应用，也是其他多种提取方法的操作基础。 随后，科学家发现核酸与硅存在特异结合，并开发了用玻璃珠吸附核酸，离心沉淀后经过洗和洗脱得到纯化的核酸样品，因玻璃珠比重较大，容易
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