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文献和实验Polybrene (sigma),10 mg/ml; 透析袋:Spectrum Co. (成卷供应,带少量甘油,硫化物与重金属), MW=8000~14400; 灭菌甘油。 操作流程: 1. 293 细胞(E1-transformed human embryonic kidney cells 在转染前24 小时接种 于1 或2 个60 mm 培养盘中,使之在转染时细胞汇合率为50-70%; 2. 在转染前,用Pac I 处理目的质粒(一般一个60 mm 细胞盘需要6μg
至7.5, 加去离子水至总体积1 升,高压下蒸气灭菌20 分钟。 2、LB 固体培养基:液体培养基中每升加12g 琼脂粉,高压灭菌。 3、氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)母液:配成50mg/ml 水溶液, -20℃保存备用。 4、溶菌酶溶液: 用10mmol/L Tris?Cl(pH8.0)溶液配制成10mg/ml,并分装成小份(如1.5ml)保存于-20℃,每一小份一经使用后便予丢弃。 5、3mol/l NaAc (pH5.2): 50ml 水中溶解40
NaAc。 四、操作步骤: (一)水稻幼苗或其它禾木科植物基因组DNA提取 1. 在50ml离心管中加入20ml提取缓冲液Ⅰ, 60℃水浴预热。 2. 水稻幼苗或叶子5-10g, 剪碎, 在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中, 剧烈摇动混匀, 60℃水浴保温30-60分钟(时间长,DNA产量高), 不时摇动。 3. 加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液, 颠倒混匀(需带手套, 防止损伤皮肤),室温下静置5-10分钟, 使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。
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