猪伪狂犬病病毒gB抗体检测试剂盒-美国爱德士（IDEXX）

猪伪狂犬病病毒gB抗体检测试剂盒说明书

Pseudorabies Virus gB Antibody Test Kit (PRV gB-Ab)

用途

猪伪狂犬病毒gB抗体检测试剂盒是一种用于测定猪血清、血浆和肌肉抽提液中猪伪狂犬病（PRV）抗体的酶联免疫试验。

概述

猪伪狂犬病由1型猪疱疹病毒引起，感染后引起死亡率高的是易感母猪产下的哺乳期仔猪。患病的仔猪表现为呼吸困难、发热、流涎、厌食、呕吐、腹泻、战栗、沉抑。在这个年龄阶段，疾病的后症状通常出现运动性共济失调、眼球震颤、运动失调、间歇性震颤、昏迷和死亡。

死亡通常出现在表现明显的临床症状后24~48小时。断奶猪和育肥猪的疾病临床特征本质相同，但死亡可能拖延4~8天。成年猪的死亡率可达2%，但通常不会出现死亡。仔猪的的疾病临床过程与成年猪本质上是一样的，存在的差异主要是胎儿可以通过胎盘感染。胎盘感染PRV，在怀孕的不同阶段，可以造成以下结果：重吸收、早产、流产、死胎、弱胎、感染的仔猪。Gustafson报道，康复的母猪群中有20%的母猪在下一次配种时将不再怀孕。

为了评估PRV的自然感染或免疫状况，可以检测血清、血浆和肌肉抽提液中的PRV抗体。所有试剂保存于2~7℃，兽用制剂。

试剂

A．PRV抗原包被的酶标板（焚烧所有用剩的材料及其容器） 60块 30块

B．辣根过氧化物酶（HRPO）标记的抗PRV gB抗体（用庆大霉素作保护剂） 60ml 350ml

C．PRV抗体阳性对照（PRV抗体加入含蛋白质稳定剂的磷酸盐缓冲液中， 用叠氮化钠作保护剂） 7ml 7ml

D．PRV抗体阴性对照（与PRV不反应的猪血清，用叠氮化钠作保护剂） 7ml 7ml E．样品稀释液（含蛋白质稳定剂的缓冲液，用叠氮化钠作保护剂） 120ml 300ml

G．10倍浓缩的清洗液235ml 440ml

H．TMB 底物溶液60ml 315ml

I．终止液60ml 315ml

原理

猪伪狂犬病毒gB抗体检测（PRV gB）是通过2倍稀释的样品在抗原包被的微孔板上进行。初次孵育时，存在于检测样品中的PRV抗体会与酶标板上的抗原结合。然后开始洗涤步骤，向微孔板中加入酶标记的抗PRV gB的单克隆抗体，进行第二次孵育，在此过程中其与抗原竞争结合。如果检测样品中不存在PRV gB抗体，酶标单抗就可以与抗原自由结合，相反，如果检测样品中存在PRV gB的抗体，酶标单抗与抗原的结合就会被阻断。而在此次孵育过后，未结合的酶标单抗就会被冲洗掉，加入底物/显色剂溶液后，在酶的存在下，底物转变为一种能与显色剂反应产生蓝色的物质。使用分光光度计测量650nm的吸收值A(650)。被检样品的A(650)值除以阴性对照的平均A(650)值，计算得出样品/阴性值（S/N）。样品中PRV抗体的含量与其A(650)和S/N值成反比。如果存在抗gB抗体，表明以前曾感染PRV野毒株或应用过普通的弱毒疫苗或灭活疫苗，或者应用过gE缺失疫苗。

自备器材

1．精确的移液器，可以吸取50μl和100μl的移液器或者多道移液器；

2．一次性吸头；

3．用来稀释洗涤液的500ml量筒；

4．96孔板酶标仪；

5．稀释样品用的玻璃或塑料试管；

6．双蒸水或去离子水；

7．滴加和7 吸去洗涤液的装置；

8．吸液用的真空泵和控制阀门。

注意事项

1．虽然病毒都经过了灭活处理，但也要严格处理所有的PRV 生物材料，要把它们当成能传播PRV 一样。

2．移液时禁止用嘴吸。

3．处理样品和试剂盒的地方禁止饮食和吸烟。

4．TMB 底物溶液和终止液可能对皮肤有刺激性。

5．某些试剂盒含有叠氮化钠作保护剂，处理时需要用大量的水冲洗以免形成叠氮化铜或叠氮化铅，它们在碰撞时可以爆炸。小心处理，防止防腐剂污染抗PRV gB 酶标记抗体。

6．避免底物TMB 被强光照射，或接触到氧化剂。盛装TMB 溶液的容器要用干净的玻璃或塑料器皿。

7．所有试剂一律2~7℃保存。所有试剂用前恢复至室温18~23℃；使用后再放回2~7℃。

8．用过的材料在弃去前要进行无害化处理。

9．小心操作防止试剂盒成分被污染。

10．不要使用过期的试剂盒组分；禁止非同批试剂盒组分混用。

11．严格按照操作程序，仔细地吸液、计时、充分洗涤，保持精确和准确，这样将获得佳检测结果。

样品和试剂盒对照准备

用样品稀释液将被检血清样品和试剂盒提供的对照品作 2 倍稀释(如100μl 血清加入100μl 稀释液中)。确保每个样品换一个吸头，将每个检测样品在微量板上的位置记录到记录表上。稀释后的样品血清，

在加入包被孔之前，要充分混匀。

洗涤液制备

使用前，将浓缩的洗液恢复到室温，摇动混合，使析出的盐类完全溶解。浓缩洗液（10×）在使用前需要用蒸馏水或去离子水按10 倍稀释（如：每块板检测需要30ml 浓缩洗液加270ml 蒸馏水）。

操作步骤

注意：所有试剂在使用前一律恢复至室温（18~23℃）。试剂应该旋转或颠倒混匀。

1．取出PRV 抗原包被板，在记录纸（表）上记录样品位置。

2．加100 μl 2 倍稀释的阴性对照血清至A1、B1 孔。

3．加100 μl 2 倍稀释的阳性对照血清至C1、D1 孔。

4．加100 μl 稀释好的样品至相应的孔。

5．室温（18~23℃）孵育1 小时或2~7℃过夜孵育。

6．每孔用大约300 μl 稀释好的洗液洗涤微孔3~5 次。每次洗涤后，甩掉孔内的液体。在甩掉液体后，加入酶标抗体前，避免孔壁变干。在后一次甩干后，在吸水材料上轻扣板，彻底去掉剩余的液体。

7．每孔加入100 μl 抗PRV gB 酶标抗体。

8．室温（18~23℃）孵育20 分钟。

9．重复步骤6。

10．每孔加100 μl TMB 底物溶液。

11．室温（18~23℃）孵育15 分钟。

12．每孔加入50 μl 终止液终止反应。

13．以空气作为空白对照对酶标仪进行空白设定。

14．在650nm，A（650）测量和记录样品和所有对照的吸光值。

15．计算结果。

试验有效性

要使试验有效，必须满足以下条件：

阴性对照平均值减去阳性对照平均值，其差必须大于等于0.30；如测定结果无效，首先应怀疑是操作技术，并在仔细阅读产品说明后重新检测。针对抗原成分的抗体的存在与否，通过计算每个样品的S/N 值来决定。

具体方法参见样品结果的计算

结果判定

A 快速模式：

（1小时孵育/ 室温：18~23℃）

1．若S/N比值小于或等于0.60，样品为PRV抗体阳性。

2．若S/N比值小于或等于0.70但大于0.60，该样品必须被重测。如果结果相同，则过一段时间后重新从动物取样进行检测。

3．若S/N比值大于0.70，样品则为PRV抗体阴性。

B 过夜模式：

（过夜孵育/ 2~7℃）

1.S/N比值小于或等于0.50，样品为PRV抗体阳性。

2.若S/N比值小于或等于0.60但大于0.50，该样品必须被重测。如果结果相同，则过一段时间后重新从动物取样进行检测。

3.若S/N比值大于0.60，样品则为PRV抗体阴性。

备注：通过重复确认所有阳性样品。

计算方法

1. 阴性对照平均值的计算（NC）

NC = A1 A(650)+B1 A(650)

2

2．阳性对照平均值的计算（PC）

PC = C1 A(650)+D1 A(650)

2

3. 样品/阴性对照比率的计算（S/N）

S/N = 样本A(650)

NC