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文献和实验solution 3. Incubate with secondary antibody diluted in Blocking buffer for 60 min at room temp. 4. 3 x10min secondary washing solution 1 x10min alkaline phosphatese buffer 5. Detect with Chromogenic I. Stripping blot 1. Rinse blot off with 0.05
kd蛋白的Western Blot时要注意,分离胶最好选择>7%的;剥胶时要小心;转移时间需要相应延长;要做分子量参照(否则出现杂带不知道如何分析)。N. 有什么方法可以提高上样量?解答:可以浓缩样品;增大上样体积来增大上样量。O. 我要检测的目的蛋白是分子量大概为42kd的膜蛋白,膜蛋白提取可不可以不用到超速离心机,有没有直接用低温高速离心机就可以的提到膜蛋白的方法,42kd的蛋白分子量算不算大?解答:如是需要提取膜蛋白,(而不是只需要提取膜蛋白),可以用Ripa buffer提取膜蛋白和胞浆
总蛋白。 以上避免stripping主要从节约时间的因素考虑,实际上当上述2、3点存在时,个人还是会用stripping buffer简单漂一下,然后用TBST换液漂洗3次再上第二种抗体;但如果时间较紧,就会真的省略。 Stripping膜至少有三种方法: A.用TBST一直洗膜,洗8hrs以上就可以清除多数蛋白的信号,信号过强的蛋白如内参除外。所以,当你的抗体非常弱的时候,孵育过夜实际上相当于stripping,新的信号不会出现,原来的信号也会被漂洗干净,出现白板。 B.请参考
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