果糖-6-磷酸激酶（6-phosphofructokinas

  果糖-6-磷酸激酶（6-phosphofructokinase，PFK）试剂盒

                                      分光光度法 50管/48样

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

PFK（EC 2.7.1.11）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，负责将果糖-6-磷酸和ATP转化为果糖-1,6二磷酸和ADP，是糖酵解过程的关键调节酶之一。

测定原理

PFK催化果糖-6-磷酸和ATP生成果糖-1,6-二磷酸和ADP，bing 酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH氧化生成NAD⁺，在340nm下测定NADH下降速率，即可反映PFK活性。

需自备的仪器和用品

紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

 

试剂的组成和配制

提取液：60mL×1瓶，4℃保存；

试剂一：液体40mL×1瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1瓶，-20℃保存，临用前加入2.8mL蒸馏水充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20度保存，禁止反复冻融；

试剂三：粉剂×1支，4℃保存，临用前加入260μL蒸馏水充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20度保存，禁止反复冻融；

试剂四：液体16μL×1支，4℃保存，临用前加入260μL蒸馏水充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20度保存，禁止反复冻融。

 

 

生化试剂盒的通用测定步骤可分为 前期准备、试剂配制、参数设置、校准与质控、样本检测、结果计算 六大核心环节，具体细节如下：

一、前期准备

1. 试剂准备：检查试剂盒各组分（R1、R2、校准品、质控品等）是否齐全、无异常（如浑浊、沉淀、变色），按要求从储存环境取出，平衡至室温（通常 20~25℃，平衡时间 5~30 分钟，具体以试剂盒说明为准），轻轻摇匀备用。

2. 样本准备：确认待检测样本类型符合要求，已按规范完成采集与处理（如血清 / 血浆样本离心分离、组织匀浆制备、尿液离心去沉淀等）；若样本需稀释或预处理（如去除干扰物），提前完成相关操作。

3. 仪器准备：确认使用的生化分析仪 / 酶标仪等仪器符合试剂盒适用要求，提前开机预热，进行仪器清洁（避免残留污染），准备好所需耗材（如反应杯、移液枪头）。

 

二、试剂配制（如适用）

1. 即用型试剂：无需额外配制，平衡至室温后直接使用。

2. 需混合试剂：按试剂盒规定比例（如 R1:R2=4:1、3:1 等）准确混合试剂组分，现配现用，避免提前配制导致试剂失效。

3. 校准品配制：用指定稀释液（如试剂盒配套稀释液、生理盐水）将校准品稀释至所需浓度梯度（通常 3~5 个梯度，如 0、20、40、80、160 nmol/L），稀释后充分摇匀备用。

 

三、仪器参数设置

根据试剂盒要求及所用仪器型号，设置核心检测参数：

1. 基础参数：检测方法（终点法、速率法、两点法等）、孵育温度（通常 37℃）、反应时间（含孵育时间和检测时间）。

2. 波长参数：主检测波长（如 450 nm、540 nm，根据反应产物特征吸收峰确定），若存在背景干扰，需设置副波长进行校正。

3. 液量参数：明确试剂与样本的比例（如 R1 200 μL + 样本 20 μL，孵育后加 R2 50 μL），确保移液体积准确。

 

 

四、校准与质量控制（保障结果准确性）

1. 校准程序：将配制好的各浓度梯度校准品依次加入反应杯，按设置的参数进行检测，记录各校准品的吸光度值 / 吸光度变化率；以校准品浓度为横坐标（X 轴）、对应吸光度相关值为纵坐标（Y 轴），采用指定拟合方式（如线性回归、Spline 拟合）绘制标准曲线，要求相关系数 R²≥0.990（具体以试剂盒性能指标为准）。

2. 质控程序：同步测定高、中、低三个水平的质控品，检测完成后查看质控结果是否在规定靶值范围内；若超出范围，需排查试剂、仪器、操作等环节问题，解决后重新进行校准与质控。

 

五、样本检测

1. 按仪器参数设定的试剂 / 样本比例，依次向反应杯加入对应试剂和待检测样本，确保加样顺序正确（如先加 R1 和样本，孵育后再加 R2）。

2. 按规定的孵育温度和时间完成反应，避免反应不充分或过度反应。

3. 反应结束后，仪器自动读取各样本的吸光度值 / 吸光度变化率，记录原始数据。

 

六、结果计算与记录

1. 依据绘制好的标准曲线，结合样本的吸光度相关值，自动或手动计算样本中被测物的浓度 / 活性（如公式：被测物浓度 =（样本吸光度值 - 空白吸光度值）× 校准品浓度 /（校准品吸光度值 - 空白吸光度值））。

2. 记录检测结果，同时标注校准曲线相关系数、质控结果等关键信息，便于后续结果追溯与验证。

 

注意事项：

 

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