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- 2025年07月28日
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- 文献和实验
- 技术资料
- 保质期：
6-12months
- 英文名：
Recombinant Osteonectin (ON)
- 库存：
大量
- 供应商：
康朗生物
- 规格：
50ug/100ug/1mg
www.shklbio.com
1.基因扩增
（1）引物合成
搜索目标蛋白基因信息，结合蛋白的结构信息，选取片段或全长设计引物。注意避开跨膜区，以及复杂的二级结构，优选N端或C端，引物评分尽可能高，并搜索出核酸序列的酶切位点，使用载体等信息。经研发部根据研发经验提出修改意见最终定稿后交由第三方公司进行引物合成。
（2）基因克隆机重组鉴定
1）PCR
根据目的蛋白特异性表达组织，选取特异组织RNA用上述引物进行PCR扩增。进行琼脂糖凝胶电泳后，根据分子量大小选取目标片段进行切胶回收。再次PCR扩增，获得大量DNA，并进行PCR产物回收。
2）酶切，连接
根据酶切位点，将目标PCR产物以及相应载体进行酶切，获得粘性末端的DNA产物后，进行琼脂糖凝胶电泳，根据目标条带大小选取相应片段切胶回收。并将具有相同酶切位点的载体与DNA片段进行连接
3）转化，挑菌验证
将连接好的目的片段转化感受态E.coli,并在LB平板上进行过夜培养。挑取平板上的菌斑进行验证PCR，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据目标条带大小选取相应菌液进行测序，测序正确后留种保存。
2.蛋白表达
（1）蛋白表达小试
挑取少量菌种进行培养，并诱导表达，将表达的蛋白进行SDS-PAGE，根据目标条带大小判断目标蛋白是否表达，小试表达成功后将进行蛋白预放大实验
（2）蛋白放大实验
将小试表达成功的蛋白菌株用400-800 ml培养基进行培养表达，进行SDS-PAGE，根据目标条带大小判断目标蛋白是否表达成功，预放大实验成功后将进行进一步的蛋白放大实验，放大实验使用800-1600 ml培养基进行培养，具体验证同上。
3.蛋白纯化
由于载体中包含了his标签，故采用镍柱进行纯化。有些蛋白可能会形成包涵体，在之前的一篇专题中我们有详细介绍过大肠杆菌重组蛋白纯化方法,纯化后的蛋白会进行SDS-PAGE， BCA等实验分子量以及纯度进行验证，纯度超过95%。
4. 质量检测
获得蛋白后会进行冻干，冻干之后会进行常规蛋白实验进行验证，合格后保存。
重组蛋白的制备主要是依据以上原理及步骤。以上是以原核表达举例。在制备过程中每一个环节都至关重要，不同的蛋白会在不同的环节出现技术难点，包括目的基因的扩增，包涵体的形成都会对重组蛋白的研发造成困境。但Cloud Clone Corp. 具有多年研发经验，还可提供真核表达系统，哺乳动物细胞表达系统，用户可根据需要选择，同时对蛋白有特殊要求我们也可提供私人定制。
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文献和实验【热门靶点解析】TGF-β信号通路+重要作用+药物研发！（建议收藏）
转化生长因子-β（TGF-β）是分泌型多肽生长因子家族的原型，由33个基因编码，参与调控细胞增殖、分化、迁移与凋亡，维持机体稳态。其家族分为经典TGF-β亚群（如TGF-β1-3、激活素等）和骨形态发生蛋白（BMP）亚群。其中，TGF-β1是研究最深入的亚型，在免疫细胞中广泛表达，具有强效促纤维化作用，几乎可由所有细胞合成。其基因位于19q3，编码产物在人与鼠间同源性高达99%，序列高度保守，功能相似，广泛参与组织修复、血管生成及免疫调节等生物学过程。 TGF-β1的激活 TGF-β1在体
1（B220抗体；ATCC号TIB146）、GK1.5（CD4抗体；ATCC号TIB207）、3.155（CD8抗体；ATCC号TIB211）、M5/114（MHCⅡ抗体；ATCC号TIB120） 6. 兔补体（Pel-Freez） 7. RPMI-5完全培养基 8. 小鼠GM-CSF（mGM-CSF）：可以来源于纯化的重组蛋白，也可来源于转染小鼠GM-CSF基因的细胞系的条件培养基 9. 用于流式细胞检测DC的抗体：如MHCⅡ类分子的杂交
一旦被置于体外培养后，这种差异就开始发生了。 5.什么是无血清培养基？与普通培养基有什么区别？ 答：无血清培养基(serum free medium,SFM):是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。但是它们可能包含个别蛋白或大量蛋白组分。基本成分为基础培养基及添加组分两大部分。添加组分可能包括纤连蛋白、层粘连蛋白等贴壁因子、胰岛素、转铁蛋白、硒等。 6.什么是无血清无动物组分培养
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