- ￥1280 - 3980
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- 2026年01月16日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 保质期：
6-12months
- 英文名：
Recombinant Mitogen Activated Protein Kinase 14 (MAPK14)
- 库存：
大量
- 供应商：
康朗生物
- 规格：
50ug/100ug/1mg/50ug/100ug/1mg
| 规格： | 50ug/100ug/1mg | 产品价格： | ￥1280.0-￥3980.0 |
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| 规格： | 50ug/100ug/1mg | 产品价格： | ￥1280.0-￥3980.0 |
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1.基因扩增
（1）引物合成
搜索目标蛋白基因信息，结合蛋白的结构信息，选取片段或全长设计引物。注意避开跨膜区，以及复杂的二级结构，优选N端或C端，引物评分尽可能高，并搜索出核酸序列的酶切位点，使用载体等信息。经研发部根据研发经验提出修改意见最终定稿后交由第三方公司进行引物合成。
（2）基因克隆机重组鉴定
1）PCR
根据目的蛋白特异性表达组织，选取特异组织RNA用上述引物进行PCR扩增。进行琼脂糖凝胶电泳后，根据分子量大小选取目标片段进行切胶回收。再次PCR扩增，获得大量DNA，并进行PCR产物回收。
2）酶切，连接
根据酶切位点，将目标PCR产物以及相应载体进行酶切，获得粘性末端的DNA产物后，进行琼脂糖凝胶电泳，根据目标条带大小选取相应片段切胶回收。并将具有相同酶切位点的载体与DNA片段进行连接
3）转化，挑菌验证
将连接好的目的片段转化感受态E.coli,并在LB平板上进行过夜培养。挑取平板上的菌斑进行验证PCR，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据目标条带大小选取相应菌液进行测序，测序正确后留种保存。
2.蛋白表达
（1）蛋白表达小试
挑取少量菌种进行培养，并诱导表达，将表达的蛋白进行SDS-PAGE，根据目标条带大小判断目标蛋白是否表达，小试表达成功后将进行蛋白预放大实验
（2）蛋白放大实验
将小试表达成功的蛋白菌株用400-800 ml培养基进行培养表达，进行SDS-PAGE，根据目标条带大小判断目标蛋白是否表达成功，预放大实验成功后将进行进一步的蛋白放大实验，放大实验使用800-1600 ml培养基进行培养，具体验证同上。
3.蛋白纯化
由于载体中包含了his标签，故采用镍柱进行纯化。有些蛋白可能会形成包涵体，在之前的一篇专题中我们有详细介绍过大肠杆菌重组蛋白纯化方法,纯化后的蛋白会进行SDS-PAGE， BCA等实验分子量以及纯度进行验证，纯度超过95%。
4. 质量检测
获得蛋白后会进行冻干，冻干之后会进行常规蛋白实验进行验证，合格后保存。
重组蛋白的制备主要是依据以上原理及步骤。以上是以原核表达举例。在制备过程中每一个环节都至关重要，不同的蛋白会在不同的环节出现技术难点，包括目的基因的扩增，包涵体的形成都会对重组蛋白的研发造成困境。但Cloud Clone Corp. 具有多年研发经验，还可提供真核表达系统，哺乳动物细胞表达系统，用户可根据需要选择，同时对蛋白有特殊要求我们也可提供私人定制。
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文献和实验位点的序列，包括肽库和肽芯片 [5，6] 的多种技术可用来鉴定激酶底物。此外，一种 λ 噬菌体 cDNA 表达文库的固相磷酸化筛选 [ 7，8 」以及不同蛋白质相互作用筛选方法，如覆盖方法 [ 9，11] 和酵母双杂交系统 [ 12，14] 已被应用在这方面。最近，蛋白激酶被改造成可接受人工合成的腺苷三磷酸盐（环戊基 ATP ) 模拟物，并用于鉴定特异底物。初步的研究已经证明，通过激酶来研究磷酸化的蛋白质芯片是可行的 [ 18，19] 。为了确定磷酸化位点，抗磷酸化蛋白表位 [6] 的抗体将用于蛋白
系统理论上的优缺点，并讨论蛋白质微阵列的应用将改变诊断方法和基因组和蛋白组的研究。 微小平行的微点配体结合分析的基本原理十年前就描述过。在“周围分析理论”中，Roger Ekins 及其同事 [14]解释了为什么微点分析比其他配体结合分析会更灵敏。那时，采用微小化的免役学分析系统已证明微点技术的高灵敏度和巨大的应用前景。但是，由微阵列引起的巨大兴趣来自DNA芯片的工作。在一个有海量平行方式的反应中测定几千个不同的结合反应的可能性完美地符合生物学中基因组方法的需要。全基因组测序方面的快速进展
和廉价的[12]。 在启动子下游是RBS，其跨度约为54个核苷酸，两端限定在 -35（±2）和mRNA编码序列的+19到+22之间[13]。Shine-Dalgarno(SD)位点[14,15]在翻译起始阶段与16S rRNA的3’端相互作用[16]。SD与起始密码子间的距离约为5-13bp[17]，而且此区的序列在mRNA转录物中应避免出现二级结构，否则将会降低翻译起始的效率[18]。 在RBS的5’和3’端均为A丰富区[19]。转录终止子位于编码序列的下游，作为转录终止的信号
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