新霉素-BSA抗原

WB实战指南（六）：孵育条件优化

那么如何通过改变抗体稀释液的配方，寻求抗体孵育的最佳条件呢？首先要认清，抗体稀释液没有一个绝对通用的配方；一种抗体一个脾气。其次，抗体稀释液的配方要兼顾与特异性抗体竞争抗原的强度，以及对其他区域的封闭强度两方面的平衡。目前，抗体稀释液中可以充当封闭蛋白的主要有milk，BSA和gelatin，似乎很少的样子 。。。可是，你有没有考虑过“复方”？--这下配方无限多了吧。1. 采用milk，BSA和gelatin的单方。3% milk，5% BSA，2.很多情况下单方的浓度很高了，背景问题仍不能

为什么你做出来的 Western 背景很脏？原因也许是……

是不是做 Western 的时候，会遇到这样的情况呢？没错，就是背景很脏。造成背景脏的原因有很多，比如一抗没洗干净，或者二抗没洗干净，还有就是封闭的时候不完全。但其实，封闭液也是你们很容易忽略的一个环境哈。封闭液有几种？除了脱脂奶粉和 BSA 还有啥你们能想到的？第一种封闭液就是脱脂奶粉，这是异常便宜的封闭液品种，当然也应该是你们最常用的封闭液配方了。（甚至我们用过特仑苏）但是，你们应该注意到的是，脱脂奶粉中有大量的生物素，也就是说你做的蛋白要是用生物素标记的，一抗也是抗生物素的。那用脱脂

Western 实验步骤

。 2） 取出洗过的印迹膜，放入封闭缓冲液中（5% 的脱脂奶粉或 5% 的 BSA），摇床摇动，室温封闭 1.5-2 小时。 抗体的孵育 主要采用间接法，即先加入未标记的特异性一抗，抗体与膜上的抗原蛋白结合，再加入酶标（过氧化物酶或碱性磷酸酶）二抗进行检测。 1） 向封闭后的印迹膜中加入稀释过的特异性一抗，4 ℃ 孵育过夜。 2） 洗涤缓冲液洗膜 10 分钟 ×3 次。 3） 加入稀释后酶标二抗，室温孵育1小时，洗膜 3-6 次，每次 10 分钟。 检测 根据标记二抗的标记物的不同，其结果检测