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《一步法恒温支原体检测试剂盒》
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一、上海易色医疗科技有限公司三种不同原理《支原体检测试剂盒》的详细介绍
产品1:细胞培养专用《一步法恒温支原体检测试剂盒》详细介绍(点击左侧进入)
产品2:细胞及其他样品通用《PCR法支原体检测试剂盒》详细介绍(点击左侧进入)
产品3:细胞培养专用《发光法支原体检测试剂盒》详细介绍(点击左侧进入)
二、上海易色医疗科技有限公司《细胞用三款快速支原体检测试剂盒》选购指南
产品名称
《一步法恒温支原体检测
试剂盒》
《PCR法支原体检测
试剂盒》
《发光法支原体检测
试剂盒》
货号
MD001
PM008
LM009
原理
恒温扩增
PCR扩增
检测支原体特异性酶的活性
所需配套仪器
恒温水浴锅或者PCR仪。
(1)PCR仪;(2)琼脂糖电泳和拍照相关设备。
(1)发光检测仪或者具有发光检测功能的多功能酶标仪;(2)-80 ℃低温冰箱。
试剂盒价格
800元/50次
1200元/100次
1350元/50次
平均每个样品价格
16元
12元
25元
检测时间
1小时
3小时
25分钟
支原体识别率
99%
在排除假阳性和假阴性后,理论上100%
99.99%
区分支原体死活的能力
不能
不能
能
结果是否定量
不能
可以根据内参条带和支原体特异性条带的亮度关系,进行初步判断。
可以。样品的发光值与支原体污染的严重程度直接相关。
操作方便性
简单
复杂
简单
灵敏度
极高
(比30 cycles 的PCR高)
高
(与PCR的cycles数有关)
高
(与30 cycles 的PCR相当)
污染导致的假阳性概率
低
高
零
引物错配导致的假阳性概率
零
极低
不存在
假阴性概率
零
高
零
样品的前处理
不需要
如果是假阴性样品(PCR被抑制),则需要进行样品前处理
简单离心
单独检测的正确率
98-99%左右
95-100%
99%以上
综合评价
**(很好)
*(好)
***(极好)
国外同类产品对比
无
Sigma公司Lookout Mycoplasma Detection Kit.货号:MP0035
价格:3469元/24次
Lonza公司MycoAlert Plus Mycoplasma Detection Kit. 货号:LT07-710
价格:大约10000元/100次
运输
冰袋运输
常温运输或冰袋运输
干冰运输
具体选购步骤:
首先,您应该根据自己实验室的仪器情况,进行选择。如果您实验室拥有发光检测仪(Luminometer)或者具有发光检测功能的多功能酶标仪以及-80 ℃低温冰箱,我们强烈建议您选购《发光法支原体检测试剂盒》。《发光法支原体检测试剂盒》具有检测时间短、支原体检出率高、不会产生假阳性和假阴性、可以区分死活支原体等优点。如果您的实验室没有上述条件,您只能选择《一步法恒温支原体检测试剂盒》或者《PCR法支原体检测试剂盒》。
其次,您可以根据检测时间长短、产品价格、支原体识别率、假阳性和假阴性概率、样品是否需要前处理等进行综合选择。
最后,作为支原体检测领域的共识:单独使用目前市面上的任何一种支原体检测试剂盒,都无法做到100%正确,既不会漏检(假阴性),也不会多检(假阳性)。严格的支原体检测,至少需要使用两种,最好使用三种不同原理的支原体检测方法同时进行检测,才能使检测结果接近100%正确。
如果您想得到100%正确的支原体检测结果(比如,开展细胞治疗的客户,进行干细胞培养的客户,生产血清、胰酶、培养液的客户,出售各种原代培养细胞系和肿瘤细胞系的客户等),任选本公司生产的《一步法恒温支原体检测试剂盒》、《PCR法支原体检测试剂盒》和《发光法支原体检测试剂盒》中的两种进行检测,将会得到比较满意的结果,检测的正确率应该在99.9%以上。如果同时使用这三种试剂盒进行检测,检测的正确率应该在99.99%以上。
细胞培养专用《一步法恒温支原体检测试剂盒》使用说明书 (版本OJ01)
【注:PDF版本说明书,请到本网站“下载中心”页面下载!】
货号
MD001
储存条件
该产品在常温下运输,收到产品后请立即放-20 ℃冰箱保存,该条件下,至少2年内仍然有活性。
产品用途
《一步恒温法支原体检测试剂盒》主要用于检测细胞培养液或别的液体样品(如血清等)中是否含有支原体。本产品仅用于基础研究。
产品简介
哺乳动物细胞的培养,支原体(Mycoplasma)污染是个世界性的问题。支原体污染几乎可以改变细胞的所有参数,导致实验结果的不准确、甚至完全错误(支原体污染对细胞的详细危害,请参考本公司的网站:www.yisemed.com)。从2013年开始,《Nature》期刊已正式要求投稿的文章,如涉及细胞培养都要进行支原体检测。相信会有越来越多的高水平期刊将做出同样的支原体检测要求。
培养法是相对可靠的支原体检测技术,但是该方法非常耗时的,需要数周,不适合作为细胞培养液中支原体污染的快速检测。此外,通过固体培养法无法检测污染细胞的一种最常见的支原体,即猪鼻支原体(M.Hyorhinis)。这是因为猪鼻支原体无法在支原体固体培养基上形成可见的菌落。而猪鼻支原体约占所有支原体污染的20-50%。
有的实验室使用荧光染色法检测支原体,但是该方法灵敏度太低,当检测成阳性时,细胞经常已经严重污染。
目前,细胞培养液中支原体污染的检测通常使用的是PCR法。但是PCR法也有明显的缺点:(1)整个过程大约需要3个小时;(2)由于细胞培养数天后,培养液中经常含有严重抑制PCR扩增的代谢物,所以样品的前处理一般是PCR法不可或缺的环节;(3)PCR法的灵敏度有限,通常需要将培养液离心浓缩或者抽提DNA后再检测;(4)PCR产物的电泳,需要用到EB等潜在的致癌物质;(5)需要用到PCR仪、电泳槽、凝胶成像仪、离心机等仪器。
《一步法恒温支原体检测试剂盒》使用独特的恒温基因扩增技术,彻底解决了上述PCR法的缺点:(1)整个检测过程只需1小时,大大缩短了检测时间;(2)细胞培养液中的PCR抑制剂,不会抑制该产品的恒温基因扩增,所以任何情况下都无需样品的前处理;(3)恒温基因扩增的灵敏度是PCR法的10-1000倍,检测只需使用1μL的细胞培养液,无需样品的离心浓缩或者进行支原体DNA的抽提;(4)恒温基因扩增的产物无需电泳,可以通过指示剂的颜色变化直接肉眼判断反应结果;(5)无需用到PCR仪、电泳槽、凝胶成像仪、离心机等仪器,整个检测过程只需一个水浴锅。
经测试,本试剂盒可以检测:(1)M.Hyorhinis、(2)M.Fermentans、(3)M.Arginini、(4)M. hominis、(5)M. orale、(6)M. salivarium、(7)M.pirum、(8)Acholeplasma Laidlawii、(9)M. agalactiae、(10)M.bovis、(11)M. buccale、(12)M. arthritidis、(13)M. pulmonis等几乎所有常见的污染细胞的支原体(注:M.为Mycoplasma的缩写)。其中,前8种为是最常见的污染细胞的支原体种类,约占污染细胞的支原体的98%左右,本试剂盒全部认识。以上13种约占污染细胞的支原体种类的99%左右。
注意:本试剂盒无法检测Ureaplasma Urealyticum支原体!
试剂盒组成
(1) 反应管,48个
(2) 水化溶液,1.5 mL
(3) 阳性支原体DNA,50 μL
(4) 矿物油,1.5 mL
检测过程
1. 反应:操作之前,请认真看完后文的注意事项后,再进行操作。
(1) 在一个以前没有操作过支原体的房间,取3个反应管,分别标记为阳性对照管(Positive)、测试管(Test)和阴性对照管(Negative),而后各加入25 μL的水化溶液(-20℃保存的水化液可以放37℃水浴融化),吹吸数次直到所有冻干粉剂彻底溶解(冻干品较难溶解,需要缓慢吹吸约20-50下。此过程,如有大气泡产生或者小气泡过多,必须去除,否则严重影响反应结果!气泡的去除方法请见注意事项)。将所有反应管盖子盖上,在另外一个房间内进行下一步的操作。
(2)往阳性对照管中加入1 μL阳性支原体DNA,而往测试管中加入1 μL待测细胞培养液,阴性对照管可以不加。
(3)选择以下方式之一进行反应:
① 水浴内反应:往每个反应管内加入25 μL矿物油,以防止水份挥发,盖上盖子,将反应管插入带孔的漂板内,放入已经升温到61℃的水浴内,准确反应60分钟。
注:本试剂盒所用的酶对温度非常敏感,只允许仪器显示温度与实际温度的温差不超过0.5℃。如果温差超过2℃,将导致酶活性大幅降低,进而扩增速度也大幅降低,导致说明书规定的反应时内,阳性对照可能无法呈现典型的蓝绿色。此时需用温度计校准水浴的温度。
② PCR仪上反应:有PCR仪的实验室,强烈建议在PCR仪上进行反应,这样可以准确控制反应的时间和温度。PCR仪参数如下:61℃,60 min;20℃, ∞;热盖温度,100 ℃。
注:在带热盖的PCR仪上进行反应,无需在反应管内加入矿物油。
2. 结果判断:61℃反应60分钟后,立刻取出反应管,放于室温。以一张白纸或白色泡沫盒(优选白色泡沫)为背景,通过反应管溶液颜色的变化,即可判断检测结果。如果溶液为蓝绿色,则说明有支原体污染;如果为粉红色或紫红色,则说明没有支原体污染(如图1)。
注1:有时,同一批次阴性反应之间的颜色也可能会略有差异(比如有些呈粉红色,有些呈紫红色或者略带紫),只要一个反应管的颜色与阳性对照有显著区别,就应该判为阴性。因为如果是真正的阳性反应,其颜色会与阳性对照的颜色几乎完全一样,即呈典型的蓝绿色。
注2:反应结果的判断,必须在反应后2小时内进行判断,因为即使在室温,扩增反应也会缓慢进行,所以如果反应管在反应后室温放置过久(比如24小时),反应管的颜色也会逐渐变化,有可能会出现假阳性,此时进行结果判断,极有可能出现错判。注3:如果试剂盒已经过期或者发生其他意外情况影响酶活性时,万一发现:61℃反应60分钟后,阳性不呈明显的蓝绿色,可以考虑将已经反应60分钟的反应管,继续在61℃的水浴或PCR仪上反应10分钟。但是如果61℃反应60分钟后,阳性已经呈现明显的蓝绿色并且阳性与阴性的区别一眼就可以看出,不得继续反应,否则可能出现假阳性。以上只是意外情况下的补救措施。
图1. 左边为阴性反应结果,右边为阳性反应结果。
注意事项
1. 冻干粉溶解方法(一):冻干品较难溶解,需要缓慢吹吸约20-50下,由于水化液中含有表面活性剂,吹吸过程很容易产生气泡,如图2A所示的小气泡不影响反应结果。但是如有图2B所示的大气泡产生,则会严重影响反应结果,必须彻底去除!气泡去除方法:(一)盖上盖子,将反应管套在0.5 mL的管子内,再将0.5 mL的管子套入1.5 mL的管子内,同时剪掉0.5 mL和1.5 mL的离心管盖子,在普通台式离心机上,≧13000 rpm,离心1分钟。(二)盖上盖子,将反应管用手指捏住,用力甩动数下。经验证,此方法可以去除几乎所有的大气泡,但是无法去除小气泡。(三)将反应管在室温静置20-30分钟,大部分气泡可以自动消失。注:条件许可,尽量采取第一种方式去除气泡。
图2. (A)液体表面的少量小气泡,不影响反应;(B)大气泡,严重影响反应,必须去除。
2. 冻干粉溶解方法(二):如果一次同时进行大批量的检测(一次检测超过30个样品),可以采取以下方式溶解冻干粉:直接往每个反应管中加入25 μL的水化溶液(每加一管,更换新的吸头,以此保证每次移液的准确性,同时防止将整管水化液污染),无需吹吸,盖上盖子后,室温静置15分钟以上(让冻干粉充分水化),用左手拇指和食指捏住反应管的上部,用右手食指轻弹反应管的底部,使冻干粉彻底溶解。如果冻干粉无法彻底溶解,可以再在室温静置5分钟,重复该操作。该方法有两个优点:(1)由于无需吹吸,不容易产生气泡;(2)进行大批量检测时,可以节约很多时间。当然,如果觉得冻干粉溶解方法(一)很容易产生气泡又不想离心,时间也不紧张,检测少量的样品也可以采取本方法溶解冻干粉。
3. 待测样品的准备:为了准确判断细胞是否有支原体的污染,待测的细胞培养液样品最好来源于培养数天且汇合度在70-90%左右的细胞培养上清(贴壁细胞),无需离心。悬浮细胞则直接使用细胞培养液,也无需离心。哺乳动物细胞的存在不会影响检测结果。收集的待测细胞培养液样品如果不立即检测,请放于-20℃或-80℃冰箱保存,不得放于室温或4℃冰箱。样品在-20℃至少可以保存一个月,在-80℃可以长期保存。此外,为了节约检测成本,可以将不同时间收集的样品放于-20℃或-80℃冰箱保存,而后一起检测。
4. 由于恒温扩增所用的各种酶强烈依赖溶液中的二价离子,请确保所检测的细胞上清或经抽提的核酸样品没有EDTA等金属离子螯合剂(样品中EDTA浓度不能超过0.05 mM,最好没有)。所以:(1)利用本试剂盒进行支原体检测,贴壁细胞传代时,如果需用含EDTA的胰酶消化细胞,则消化后请加适量的培养液并离心,去除含EDTA和胰酶的上清,用培养液重悬细胞后培养。(2)本试剂盒可直接使用细胞上清进行检测。如果样品已经用试剂盒提取支原体的DNA,请用去离子水溶解DNA。
5. 请确保样品加入后,反应之前:阴性、阳性和所有待测样品的颜色基本一致。如果个别样品,一旦加入,反应管的颜色就与阴性、阳性明显不同,说明其中含有可干扰本系统正常指示效果的物质,必须先去除。此现象曾经在检测CHO无血清培养基上发生过。常见的DMEM、MEM、F12、1640等培养基一般不会发生该现象。去除方法:取1 mL细胞上清,先13000 rpm离心5 min,吸走950 μL上清;加PBS 950 μL,再次离心,吸走950 μL上清;再加PBS 950 μL,第三次离心,吸走950 μL上清;吹匀剩余的50 μL,取1 μL进行检测。
6. 如果在水浴锅内反应,在反应之前,水浴锅必须先升温到61℃,再放入反应管。此外,必须用温度计测量水温,确保水浴锅的温度准确。
7. 在61℃反应的时间必须准确计时,超过说明书规定的反应时间可能会出现假阳性(最多不得超过2分钟)。个别批次的最佳反应时间,可能会围绕60分钟上下略有变化,如有变化,会在试剂盒中特别提醒。如果没有特别提醒,请按此说明书进行反应,即61℃,反应60分钟。
8. 防DNA污染注意事项:
(1)必须确保吸取水化液的移液枪本身没有残留的支原体。因此,最好使用全新购买的移液枪。如果没有新购买的移液枪,至少应该使用以前没有进行过细胞培养的移液枪吸取水化液。因为进行过细胞培养的移液枪极有可能被含支原体的培养液污染(如细胞培养时,不小心将含支原体污染的培养液吸入移液枪的枪体内)。由于本试剂盒非常灵敏,移液枪中吸附的支原体有可能造成不必要的假阳性。
(2)最好使用带滤芯的吸头吸取水化液和阳性支原体等。如果没有带滤芯的吸头,至少应该使用新开封的吸头。
(3)吸取水化液并溶解冻干粉的房间(请勿在细胞培养间,进行该步骤的操作),与用于样品前处理、加阳性对照DNA、样品DNA的房间一定要分开。
(4)样品前处理的各类吸头、离心管,以及吸取阳性对照DNA、待测样品DNA的吸头,务必小心处理,请将其装入含有半瓶水的带盖的、可密封的瓶子内,全部样品吸取完后,盖上瓶盖,以防止阳性DNA的挥发,造成环境的污染,进而造成假阳性。
(5)整个操作过程,最好不要说话,因为人的口腔和唾液都是带支原体的。
(6)反应后,请勿打开反应管的盖子,否则有可能造成检测环境的污染。结果判断完后,将其用自封袋密闭,扔到另外一个房间的垃圾桶内。
9. 第一次检测,可以设阳性对照管和阴性对照管,反应结束后,以白色泡沫盒为背景,将反应结果拍成彩色照片,留作日后判断结果用。由于用手机拍的照片颜色失真很厉害,拍照时请尽量用专业的数码相机并带闪光拍照(如果没有闪光,至少在光照条件好的窗口或者台灯下拍照)这样阳性和阴性的色彩区分更好。从第二次检测开始,不一定每次都设阳性和阴性对照管(当然,特别重要的样品最好还是设阳性和阴性对照),只需在反应结束后,用同样的相机和条件拍照,然后与第一次的阳性管和阴性管的照片对比即可知道结果。
10. 由于光照、是否开闪光以及各个相机的不同,阳性和阴性的拍照效果可能会与本说明书的图示效果(图1)略有不同,但不会影响到结果的判断。只要一个反应管呈明显的蓝绿色,说明为阳性反应结果;而阴性反应各个批次之间可能会有轻微的差异,只要总体呈粉红色或紫红色,则说明为阴性反应结果。总之,反应后,阳性和阴性的颜色通过肉眼必须一眼就能看出区别,才说明检测成功。11. 如发现细胞被支原体污染,本公司提供细胞专用支原体清除试剂。
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一步法恒温支原体检测试剂盒 说明书 Yisemed 20151016.pdf 附 (下载 123 次)