中性蛋白酶（Neutral protease, NP）活性测

中性蛋白酶（Neutral protease, NP）活性测定试剂盒

 

                                                 微量法 100T/48S

注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

NP在一定的温度和中性pH条件下，催化水解蛋白质。由于其安全无毒、水解能力强、作用范围广等特点，中性蛋白酶常用于食品、饲料、化妆品和营养保健品生产。

 

测定原理：

中性条件下，NP催化酪蛋白水解产生酪氨酸；在碱性条件下，酪氨酸还原磷钼酸化合物生成钨蓝；在680nm有特征吸收峰。

 

自备仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、水浴锅、磁力搅拌器、可调式移液枪、1.5 mL EP管和蒸馏水。

试剂盒的组成

基础试剂：通常为试剂 1（R1）、试剂 2（R2），部分试剂盒可能含试剂 3（R3）等，主要成分包括缓冲液、酶、底物、辅助因子等，需标注各组分的装量（mL / 瓶）或可测试数量。

配套校准 / 质控组分（如适用）：校准品：含被测物标准品，搭配特定基质（如人血清、BSA 等），提供明确靶值，且定值需溯源至国际 / 国家标准品；

质控品：含不同浓度（高 / 中 / 低）被测物，用于验证检测结果准确性，靶值范围为批特异；

配套耗材（如适用）：如塑料滴管、封板膜等，标注具体数量。

注：不同批号试剂盒的各组分不得混用；校准品、质控品的赋值仅适用于本批号试剂盒。

 

测定步骤

步骤序号	操作步骤	操作要点	注意事项
1	实验准备	1. 试剂盒组分（R1、R2、标准品、质控品）室温平衡 15-20 分钟； 2. 处理待测样本（血清 / 血浆 / 匀浆等），按需稀释； 3. 校准微量加样枪，设置酶标仪检测波长	1. 试剂避免反复冻融； 2. 样本无溶血、脂血； 3. 吸头一次性使用
2	微量加样	反应板各孔加样（单孔用量）： - 空白孔：稀释液 20μL + R1 100μL； - 标准 / 质控孔：标品 / 质控品 20μL + R1 100μL； - 样本孔：样本 20μL + R1 100μL；轻1. 严格控制温育温度与时间； 2. 反应板加盖防液体蒸发轻混匀，室温孵育 5 分钟	1. 加样顺序不可颠倒； 2. 吸头勿接触孔壁，防止挂壁； 3. 避免试剂交叉污染
3	温育反应	各孔加 R2 20μL，混匀后 37℃温育 10-15 分钟（按说明书调整）	1. 严格控制温育温度与时间； 2. 反应板加盖防液体蒸发
4	终止反应	加终止液 20μL，轻柔混匀	1. 终止液为强酸 / 强碱，需戴手套操作； 2. 快速加样，保证各孔反应同步终止
5	吸光度测定	酶标仪以空白孔调零，测定各孔 OD 值	1. 测定前确认孔底无气泡、污渍； 2. 终止反应后 10 分钟内完成检测
6	结果计算	1. 计算 ΔOD=OD 样本 / 标品 - OD 空白； 2. 以标品浓度为横坐标、ΔOD 为纵坐标绘制标准曲线； 3. 样本浓度 = 曲线查得浓度 × 稀释倍数	1. 标准曲线 R²≥0.99； 2. 质控结果需在合格范围内
7	实验收尾	1. 按生物安全规范处理反应废液2. 剩余试剂密封后冷藏保存； 3. 清洗反应板 / 器材	1. 试剂开封后尽快用完； 2. 废弃物分类处置，避免污染

 

生化试剂盒的核心分类

按检测原理和目标物类型，可分为以下几大类，覆盖多数实验场景：

1. 代谢物检测试剂盒用于检测血糖、甘油三酯（TG）、胆固醇（TC）、尿酸、乳酸、bing酮酸等小分子代谢物，原理多为终点比色法 / 速率比色法。例如血糖试剂盒通过葡萄糖氧化酶（GOD）- 过氧化物酶（POD）偶联反应，生成有色物质，吸光度与葡萄糖浓度正相关。

2. 酶活性检测试剂盒适用于 SOD、CAT、POD、LDH、ALT、AST 等酶活性测定，以速率法为主。通过监测酶促反应过程中底物或产物的吸光度变化速率，计算酶活性单位（U）。比如 SOD 试剂盒利用氮蓝四唑（NBT）光还原法，SOD 抑制 NBT 还原的程度与酶活性相关。

3. 蛋白定量试剂盒包括 BCA、Bradford、Lowry 法试剂盒，其中微量 BCA 试剂盒适合样本量少的场景。BCA 法基于碱性条件下蛋白与 Cu²⁺结合，还原 BCA 试剂生成紫色复合物，在 562nm 处有特征吸收峰。

4. 离子检测试剂盒用于检测钙、磷、钾、钠等无机离子，如钙试剂盒通过钙与偶氮砷 Ⅲ 结合生成有色络合物，进行比色定量。

 

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