高效生物素标记试剂盒

高效生物素标记试剂盒
生物素标记试剂盒-氨基
Biotin Labeling Kit-NH2
特点：整个标记过程仅需1个小时
整个标记过程在1支过滤管中进行
荧光标记抗体回收率高
适用于50-200 μg的IgG

该试剂盒主要用于制备生物素标记的蛋白质，用于酶免疫分析（EIA）。NH₂-reactive biotin是试剂盒的成分之一，它含有琥珀酰亚胺基（NHS），能与蛋白质或者其它分子的氨基反应。该试剂盒中包含了标记所需的全部试剂，标记过程十分简便。只需将NH₂-reactive biotin加入到IgG溶液中，37℃培养10分钟即可。每个IgG分子平均能够和5-8个生物素分子结合。过量的生物素分子能够使用过滤管将其除去。
备注：经过同仁化学研究所的长期稳定性考验，代码为LK03的产品在0-5℃未开封的条件下由原来可以保存半年延长至一年。
注意事项：
用该试剂盒标记的蛋白质的分子量要>50,000。
在标记过程中，IgG或者biotin-IgG标记物始终在Filtration tube的滤膜上。
如果IgG溶液中含有分子量>10,000的其他蛋白质，如BSA或明胶时，在使用该试剂盒标记前，先要纯化IgG溶液。IgG溶液能够用IgG Purification Kits（不包含于本试剂盒中）来纯化。
如果IgG溶液含有小的不溶物，离心后取上清液来进行标记。
如果长时间不使用，建议您把试剂盒中的标记试剂NH₂-reactive biotin放在-20℃冰箱中保存，不需要充氮气，可以更好地保持标记试剂的活性，但请不要把其它试剂和过滤管放到-20℃冰箱中，仍请放在0-5℃冰箱中保存。

标记IgG操作步骤
（1）将100 μl WS buffer以及含有100 μg IgG的样品溶液加入到过滤管中。^a）
（2）8,000-10,000 g离心10分钟。^b）
（3）将10 μl DMSO加入到NH₂-reactive biotin中并用移液器吹打使其溶解。^c）
（4）将100 μl Reaction buffer以及8 μl NH₂-reactive biotin溶液加入到过滤管中，吹打使其混合。^d）
（5）将过滤管放入培养箱中，37℃培养10分钟。
（6）将100 μl WS buffer加入到过滤管中，8,000-10,000 g离心10分钟，^b）除去滤液。
（7）将200 μl WS buffer加入到过滤管中，8,000-10,000 g离心10分钟，^b）重复该步骤一次。
（8）将200 μl WS buffer加入到过滤管中吹打10-15次来回收标记产物。^e）将该溶液转移到0.5 ml试管中，在0-5℃下保存。

a）样品溶液的体积不应超过100 μl。如果抗体浓度低于1 mg/ml，重复步骤1和2直至总的IgG聚积量达到100 μg。如果聚积过程中滤液的体积超过400 μl，则在进行后续的离心操作前应除去滤液。
b）如果溶液在离心后仍然残留在膜上，可以再离心5分钟或者适当增加转速。
c）NH₂-reactive biotin在管子的底部，向管底加入10 μl DMSO，吹打数次使其溶解。
d）如果IgG的量为200 μg，在步骤4时加入所有的NH₂-reactive biotin溶液。
e）并不一定要使用WS buffer来回收标记产物，可以选择任何适合于该实验的缓冲液来替代。

生物素/蛋白质 比率的测定每个IgG平均可以和5-8个生物素结合。如果需要知道精确的结合数的话，可以做一下HABA试验。参照以下HABA试验的操作说明。
方法1
试剂溶液：
用PBS(pH 7.4)制备200 μM 的HABA（4-hydroxyazobenzene-2-carboxylic acid）溶液……………1 ml
用PBS(pH 7.4)制备0.5 mg/ml 的avidin…………………………………………………………1 ml
稀释后的样品溶液（55 μl biotin标记后的蛋白质溶液+110 μl PBS，pH 7.4）
用混合溶液（2体积PBS, pH 7.4 + 1体积WS buffer）制备25 μM的生物素………………200 μl
制备不同浓度梯度的溶液（12.5 μM, 6.25 μM, 3.13 μM, 1.56 μM）…………………各200 μl

1、在塑料管中将HABA溶液和avidin溶液混合。
2、向15个孔中分别加入100 μl HABA-avidin溶液进行复孔试验。（n=3）
3、3孔1组，向每组中分别加入不同浓度（12.5 μM, 6.25 μM, 3.13 μM, 1.56 μM）的biotin溶液50 μl，向剩下的3孔中加入稀释后的样品溶液50 μl。
4、测定405 nm处的OD值（参比波长492 nm），用不同浓度的生物素溶液的OD值制备标准曲线。测定280 nm处的OD值确定蛋白浓度。（如：280 nm处IgG的摩尔吸光系数：216,000）。
5、确定样品溶液中的生物素浓度并且计算每个蛋白分子上生物素分子的数量。


方法2
生物素/蛋白质 比率的测定
试剂准备：
Avidin 10 mg
HABA 14 mg
DMSO 500 µl
PBS buffer（pH 7.4）20 ml
NaCl 8.0 g/l，KCl 0.2 g/l，Na₂HPO₄ 1.15 g/l，KH₂PO₄ 0.2 g/l

步骤：
1、在2 ml的管中加入14 mg的HABA和500 µl DMSO溶解。

2、在20 ml的容量瓶中加入Avidin 10 mg、PBS 15 ml盖上瓶盖混合均匀，然后再加入HABA-DMSO混合液200 µl混合，之后再加入PBS讲液体重量补充到20 ml（大约还需要加5 ml PBS）。

3、在容量1 ml、长1 cm的比色皿中加入HABA-Avidin混合液900 µl，在500 nm下测定吸光度，做三个复样，取平均值。测得的吸光度AbsA大约在1.5

4、在2 ml的管中加入HABA-Avidin混合液900 µl和100 µl标记好的样品溶液，均匀混合。

5、静置5分钟，吸取上清液，在500 nm下测定吸光度（AbsB）
注：如果所加的样品溶液中标记好的Biotin过多，会导致AbsB值过低，如果AbsB低于0.7以下，那么就需要稀释样品重新检测，保证AbsB值在0.7以上。（稀释倍率用Z表示）

6、计算方法：
B(mol/l)=Z × [10^-2 × (0.9×AbsA- AbsB)/34]

7、一个分子的结合率计算方法：
A(mol/l)=(X/MWprotein) ×10³
X为所用的生物素的量（g）、MWprotein为生物素的分子量
B/A=1个分子上结合的生物素的量（mol/mol）