细胞活死双染试剂-Calcein-AM+PI

细胞活死双染试剂-Calcein-AM+PI
3',6'-Di(O-acetyl)-4',5'-bis[N,N-bis(carboxymethyl)aminomethyl]fluorescein, tetraacetoxymethyl ester
3'-O-乙酰胺-2',7'-二(羧乙基)-4或5-羧基荧光素,二乙酰甲酯
Calcein-AM是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，Calcein-AM由于在Calcein(钙黄绿素)的基础上加强了疏水性，因此能够轻易穿透活细胞膜。当其进入到细胞质后，酯酶会将其水解为Calcein(钙黄绿素)留在细胞内,发出强绿色荧光。与其它同类试剂（如BCECF-AM和Carboxy-fluorescein diacetate）相比，Calcein-AM是最适合作为荧光探针去染活细胞的，因为它的细胞毒性很低。Calcein(钙黄绿素)不会抑制任何的细胞功能如增殖或淋巴球的趋化性。另外，使用了Calcein(钙黄绿素)的活性检测的实验结果是十分可信并且与标准的⁵¹Cr-释放法所得结果相一致的。Calcein(钙黄绿素)的激发和发射波长分别为490 nm和515 nm。
Calcein-AM和碘化丙啶（PI）溶液，它们分别可对活细胞和死细胞染色。Calcein-AM的乙酸甲基酯亲脂性很高，使其可透过细胞膜，通过活细胞内的酯酶作用，Calcein-AM能脱去AM基，产生的Calcein(钙黄绿素)能发出强绿色荧光，因此Calcein-AM仅对活细胞染色。另一方面，作为核染色染料的PI不能穿过活细胞的细胞膜。它穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光（激发：535 nm，发射：617 nm），因此PI仅对死细胞染色。由于Calcein(钙黄绿素)和PI-DNA都可被490 nm激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。用545 nm激发，仅可观察到死细胞。根据以上特点，Calcein-AM和碘化丙啶（PI）经常被结合用来作为活细胞和死细胞的双重染色。
由于不同细胞系的最佳染色条件不同，我们建议个别确定Calcein-AM和PI的合适浓度。
染色例：



染色过程：
1． 用DMSO制备1 mM 的Calcein-AM溶液，并用PBS将其稀释制成1-50 μM的Calcein-AM溶液。^a)
2． 将1/10细胞培养基体积的Calcein-AM溶液加入到细胞培养基中。^b)
3． 在37℃培养细胞15-30分钟。
4． 用PBS或适当的缓冲液洗涤细胞两次。
5． 用490 nm激发波长，515 nm发射波长的滤光片的荧光显微镜观察细胞。
a) 如果Calcein-AM很难进入细胞，可以使用表面活性剂，如Pluronic F127。
b) 或者您也可以用1/10浓度的Calcein-AM溶液代替培养基。

Calcein-AM可以用来进行活细胞、死细胞的双重染色
钙黄绿素-AM(Calcein-AM)和碘化丙啶(PI)溶液，它们分别可对活细胞和死细胞染色。Calcein -AM的乙酸甲基酯亲脂性很高，使其可透过细胞膜。尽管Calcein -AM本身并不是荧光分子，但通过活细胞内的酯酶作用，Calcein -AM能脱去AM基，产生的Calcein能发出强绿色荧光（激发：490 nm，发射：515 nm）。因此Calcein -AM仅对活细胞染色。另一方面，作为核染色染料的PI不能穿过活细胞的细胞膜。它穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光（激发：535 nm，发射：617 nm）。由于Calcein和PI-DNA都可被490 nm激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。用545 nm激发，仅可观察到死细胞。由于不同细胞系的最佳染色条件不同，我们建议个别确定PI和Calcein -AM的合适浓度。

I．试剂
Calcein-AM
PI

II．用荧光显微镜观察细胞形态
以HeLa细胞染色为例,请注意不同的细胞种类、不同浓度有不同的观察条件。根据细胞条件，摸索不同条件下的细胞贴壁情况和试剂浓度的配制等最佳条件。
1．染色溶液的配制
1）用1 ml无水DMSO溶解1 mg Calcein-AM，制备成1 mmol/l 的Calcein-AM储备液，-20℃下密闭冷冻保存。
2）用1 ml ddH₂O溶解1 mg PI，制备成1.5 mmol/l的PI储备液（1 mg PI/1 ml H₂O），-20℃下密闭冷冻保存。
3）将Calcein-AM储备液和PI储备液放置于室温。
4）加10 μl Calcein-AM储备液和15 μl PI储备液至5 ml PBS中配制成染色溶液。
Calcein-AM的终浓度为2μmol／l，PI的终浓度为4μmol／l。

2．细胞染色
1）染色HeLa细胞等贴壁细胞时,先用Trypsin-EDTA等消化细胞，制备成细胞悬液。
2）将细胞悬液离心3分钟(1,000 rpm)。
3）去除上清液，加入PBS缓冲液，细胞数量调整至10⁵ –10⁶ 个／ml。再用移液器充分混匀。
4）由于培养基中的血清等含有酯酶，Calcein-AM遇水会分解，会导致空白上升，所以需要离心数次，用PBS洗涤数次直到完全洗净。
5）将200 μl细胞悬液移至小试管中，加入100 μl染色溶液，在37℃下孵育15分钟。
6）在盖玻片上滴加适量的染色的细胞溶液。
7）在荧光显微镜下，先使用490±10nm波长激发，观察黄绿色的活细胞，还可以同时观察到红色的死细胞，然后用545 nm波长激发，能够看到红色的死细胞。
*在荧光显微镜下观察时，如果背景高，可以用培养基清洗掉细胞外的染料后再观察。
*Calcein-AM溶液和PI溶液可以混合在一起染色，也可以分开进行染色，加入的先后顺序没有影响。

3．染色试剂的最佳浓度
Calcein-AM和PI的最适浓度是根据不同的细胞种类而定，通过以下的操作，我们可以找到不同细胞染色试剂的最佳浓度。
1）通过在0.1%皂苷或0.1-0.5%毛地黄皂苷中孵育10分钟或通过在70％乙醇中孵育30分钟制备死细胞。
2）用0.1-10 μM 的PI溶液对死细胞染色，以便找到仅对细胞核染色而不对细胞质染色的PI浓度。
3）用0.1-10 μM 的Calcein-AM溶液对死细胞染色，以便找到不对细胞质染色的Calcein -AM浓度。接着用该浓度的Calcein -AM对活细胞染色以检验活细胞可否被染色。

III．注意事项
1） Calcein-AM的ester部位遇到湿气会分解，使用后请在-20℃下密闭冷冻保存，防止水分进入。Calcein-AM储备液用缓冲液或培养基等稀释时尽量现配现用。
2）PI溶液在冷冻的条件下可以保存一年。PI有引致癌的可能性,请在使用时注意以下3点。
·使用时一定要带手套、眼罩、口罩。
·万一接触到皮肤的话，迅速使用大量水清洗。
·处理方法
使用器具的洗涤液等废液请按照不同的处理方法来处理，或者按照如下的处理方法，分解后再丢弃。用UV照射或光照分解。用次氯酸钠氧化分解后，做中和处理。
文献参考