HieffT™ qPCR Probe Master Mix

HieffT™ qPCR Probe Master Mix产品描述

HieffTM qPCR Probe Master Mix是2×浓缩的qPCR预混合溶液，专为高特异性、高灵敏度实时定量PCR而设计。Mix中含有热启动的HieffTM DNA Polymerase，配合针对qPCR优化的最适Buffer，可以有效抑制非特异性的PCR扩增，从而显著提高PCR反应的扩增效率，使定量PCR可以在宽广的定量区域内获得良好的线性关系。本产品与绝大多数厂商的实时荧光定量PCR仪兼容。

HieffT™ qPCR Probe Master Mix产品组分

组分

产品编号/规格

11204ES03（1 ml）

11204ES08（5×1 ml）

HieffTM qPCR Probe Master Mixa

1 ml

1 ml×5

High ROXb

40 μl

200 μl

Low ROXb

40 μl

200 μl

a: 包含HieffTM DNA Polymerase，dNTP Mix，Mg2+；

b: 用以校正孔与孔之间产生的荧光信号误差。

High ROX适用于以下仪器：ABI 7900HT/7300 Real-Time PCR System和StepOne PlusTM；

Low ROX适用于以下仪器：ABI 7500，7500 Fast Real-Time PCR System，Stratagene Mx3000P；

Roche, Bio-Rad的Real Time PCR仪不必使用ROX。


HieffT™ qPCR Probe Master Mix
运输与保存方法

冰袋运输。

本产品应置于-20℃避光储存；尽量避免反复冻融，如每次使用量较少，推荐小份分装使用，有效期半年。

操作流程（以Hela基因组DNA为模板，PCR仪为ABI StepOneTM Plus）

1. 上下颠倒混匀Mix，避免剧烈震荡以免产生过多气泡。Mix经轻微离心后即可使用。

2. qPCR反应体系配制

试剂

体积1（50 μl）

体积2（20 μl）

HieffTM qPCR Probe Master Mix

25 μl

10 μl

Primer 1（10 μM）

1 μl

0.4 μl

Primer 2（10 μM）

1 μl

0.4 μl

TaqMan Probe(10 μM)

0.5 μl

0.2 μl

High/Low ROX

1 μl

0.4 μl

模板DNA

X μl

X μl

无菌蒸馏水

Up to 50 μl

Up to 20 μl



注：

1) 反应体系中引物浓度一般在0.1-1.0 μM之间，一般引物终浓度为0.2 μM扩增效果较好；

2) 探针终浓度在50 nM-250 nM之间；

3) cDNA模板的体积不要超过反应体积的1/10；

4) qPCR灵敏度极高，建立反应体系时加入模板量的准确程度对最终定量结果会有很大的影响。 因此如仪器允许，推荐您使用50 μl反应体系，并且将模板稀释后（如稀释至5 μl/样本）加入反应体系中， 这样可以有效提高实验的重复性。

3. 设置PCR 反应程序

本实验以两步法程序为例，即退火/延伸设置在60℃。也可以用三步法进行PCR扩增反应。

95℃

5 mina

预变性

95℃

10 sec

循环反应（40 cycles）

60℃

30 secb

注：a: HieffTM DNA Polymerase需要热激活处理以恢复酶活性，如果模板中GC含量较高，可将预变性时间延长至10分钟。

b：延伸时间需要根据定量PCR仪所需要的数据采集最短时间限制自行调整，ABI 7700和7900HT设定为30 sec；使用ABI 7000和7300设定为31 sec；使用ABI 7500设定为34 sec；使用ABI StepOneTM Plus时设定在至少10 sec。

4. 反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线，进行标准曲线制作等。也可用琼脂糖凝胶电泳进行确认PCR扩增产物特异与否。

引物设计指南

1）引物长度17 bp-25 bp最好。太短的引物容易导致扩增效率降低，太长的引物会导致引物高级结构出现几率增加；

2）引物的GC含量控制在40%-60%之间，最佳为45%-55%；

3）引物A、G、C、T整体分布尽量要均匀，避免使用GC或者TA含量高的区域，尤其是3’端，必须避开GC含量不均匀的区域；

4）尽量避开T/C或者A/G的连续结构；

5）引物3’端最后5个碱基不能包含超过2个以上的G或者C；

6）正向或者反向引物应尽量接近探针序列，但是不能和探针序列有重合区域。

TaqMan探针设计指南

1）探针序列应尽量接近正向或者反向引物，但不能与之有重合区域；

2）探针长度一般为18-40 bp；

3）应避免连续相同的碱基出现，特别是要避免4个连续G的出现；

4）探针5’端应避免使用碱基G；

5）探针的退火温度应为65-67℃；

6）如果序列中包含多态性位点，应使其位于探针序列中间。

探针法qPCR反应有效性确认标准

1） 线性关系以及扩增效率确认：

标准曲线相关系数（R2）＞0.98

标准曲线斜率介于 -3～-3.5之间

PCR扩增效率（E）介于0.9～1.2之间

2） 重复性确认：重复管之间的STD＜0.2
HieffT™ qPCR Probe Master Mixyb1705 GPx 谷胱甘肽过氧化物酶分析试剂盒 Glutathione Peroxidase Assay 100 tests
yb1706 COX 细胞色素C氧化酶含量试剂盒 Cytochrome C Oxidase Assay 100Tests in cuvette
yb1707 CS 柠檬酸合成酶的检测试剂盒 Citrate Synthase Assay 100Tests in cuvette
yb1708 GDH 谷氨酸脱氢酶检测试剂盒 Glutamate Dehydrogenase Assay 100 Tests in 96-well plat
yb1709 HK 己糖激酶检测试剂盒 Hexokinase Assay 100 Tests in 96-well plat
yb1710 G6PDH 萄糖-6-磷酸 磷酸脱氢酶检测试剂盒 Glucose-6-phosphate Dehydrogenase Assay 100 Tests in 96-well plat
yb1711 XO 黄嘌呤氧化酶分析试剂盒 Xanthine Oxidase Assay 100 Tests in 96-well plat
yb1712 ALT "丙氨酸转氨酶分析试剂盒
" Alanine Transaminase Assay 100 Tests in 96-well plat
yb1713 GPDH 甘油醛3磷酸脱氢酶分析试剂盒 Glycerol-3-phosphate Dehydrogenase Assay 100 Tests in 96-well plat
yb1714 GST "谷胱甘肽S转移酶分析试剂盒
" Glutathione S-transferases Assay 100 Tests in 96-well plat
yb1715 ADH "乙醇脱氢酶分析试剂盒
" Alcohol Dehydrogenase Assay 100 Tests in 96-well plat
yb1716 ALDH " 醛脱氢酶分析试剂盒
" Aldehyde Dehydrogenase Assay 100 Tests in 96-well plat
yb1717
yb1718 阳离子阴离子检测试剂盒
yb1719 MGPA 孔雀绿磷酸盐检测试剂盒 Malachite Green Phosphate Assay 2500 tests/96 well plate
yb1720 CCA 比色法钙分析试剂盒 Colorimetric Calcium Assay 250 tests/96 well plate
yb1721 Ir 铁元素检测试剂盒 Iron Assay 100 tests
yb1722 代谢物检测试剂盒
yb1723 LAC L - 乳酸含量分析试剂盒 L-Lactate Assay 100 Tests in 96-well
yb1724 GLU 谷氨酸检测试剂盒 Glutamate Assay 100 Tests in 96-well plat
yb1725 NAD "NAD/NADH 含量检测试剂盒
" "NAD/NADH Assay
" 100 Tests in 96-well plate
yb1726 PYR 丙酮酸检测试剂盒 Pyruvate Assay 100 Tests
yb1727 G6P 6-磷酸葡萄糖检测试剂盒 Glucose-6-phosphate Assay 100 Tests
yb1728 GL 葡萄糖检测试剂盒 Glucose Assay 100 Tests
yb1729 UA 尿素检测试剂盒 Uric Acid Assay 100 Tests