b. 对于大多数模板在95℃变性时间设为5~10 sec即可。对于高GC含量模板,变性温度需提升至98℃;对于超过10 kb的扩增子,变性温度需降低至92℃,并延长变性时间至15 sec。
c. Pfu DNA Polymerase能够促进模板和引物高效退火。一般来说,退火温度设置为引物Tm值±3℃范围内之间即可。如果需要,可以建立一个温度梯度反应去寻找引物模板结合的最适温度。退火时间太长可能导致扩增产物在胶上呈现弥散状。因此,推荐退火时间设置为10 sec即可。对于一些困难模板,退火时间可在10~30 sec之间调整。
d. 对于大多数扩增反应,延伸过程可在72℃进行。对于超过10 kb的扩增片段,需降低延伸温度至68℃。延伸时间取决于扩增片段的长度和模板的复杂性。使用质粒等复杂程度较低的DNA做模板时,可使用15 sec/kb的延伸时间;使用基因组, cDNA等复杂程度较高的DNA做模板时,延伸时间应为30 sec/kb。太长的延伸时间会导致非特异性扩增增加,因此延伸时间请勿超过30 sec/kb。