活性氧检测试剂盒/Reactive Oxygen Speci

活性氧检测试剂盒/Reactive Oxygen Species Assay Kit/ROS Assay Kit检测原理

活性氧检测试剂盒（Reactive Oxygen Species Assay Kit）是一种基于荧光染料DCFH-DA（2,7-Dichlorodi -hydrofluorescein diacetate）的荧光强度变化，定量检测细胞内活性氧水平的最常用方法。

DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜。进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不会通透细胞膜，因此探针很容易被积聚在细胞内。细胞内的活性氧能够氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。绿色荧光强度与活性氧的水平成正比。在最大激发波长480nm，最大发射波长525nm处，使用荧光显微镜，流式细胞仪或激光共聚焦显微镜等检测荧光信号，并根据阳性对照Rosup的荧光信号来分析活性氧的真正水平。

产品组分

编号

组分

规格

保存方法

50101-A

DCFH-DA（10mM）

0.1 mL

-20℃，避光保存

50101-B

活性氧阳性对照（Rosup, 50mg/mL）

1.0 mL

-20℃，避光保存

运输与保存

冰袋运输。-20℃干燥避光保存，有效期一年。

活性氧检测试剂盒/Reactive Oxygen Species Assay Kit/ROS Assay Kit检测步骤

1）装载探针

对于刺激时间较短(通常2小时以内)的细胞，先装载探针，后用活性氧阳性对照及感兴趣药物刺激细胞。对于细胞刺激时间较长(通常为6小时以上)的细胞，先用活性氧阳性对照及感兴趣药物刺激细胞，后装载探针。

原位装载探针：仅适用于贴壁细胞。

（1）按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，终浓度为10 umol/L。

（2）去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA。加入的体积以能充分盖住细胞为宜，对于六孔板通常不少于100ul。

（3） 37℃细胞培养箱内孵育20 min。用无血清培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30分钟后可以显著提高活性氧水平。

收集细胞后装载探针：适用于贴壁细胞和悬浮细胞。

（1）按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，终浓度为10 umol/L。

（2）收集好的细胞悬浮于稀释好的DCFH-DA，细胞密度为1.0×106~2.0×107。

（3）37℃细胞培养箱内孵育20分钟。每隔3-5分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。

（4）用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。直接用活性氧阳性对照

或自己感兴趣的药物刺激细胞，或把细胞等分成若干份后刺激细胞。通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30分钟后可以显著提高活性氧水平。

2）检测

原位装载探针法：激光共聚焦显微镜直接观察，或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。

收集细胞后装载探针：用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，也可以用激光共聚焦显微镜直接观察。

3）参数设置

使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。DCF的荧光光谱和FITC非常相似，可以用FITC的参数设置检测DCF。DCF的激发光谱和发射光谱参考下图。



其他事项说明：

（1）阳性对照推荐按照1∶1000的比例使用。如用1μL的阳性对照刺激1mL装载好探针的细胞。通常刺激后20～30分钟内可以观察到非常显著的活性氧水平升高。对于不同的细胞，活性氧阳性对照的效果可能有较大的差别。如果在刺激后30分钟内观察不到活性氧的升高，可以适当提高活性氧阳性对照的浓度。如果活性氧升高得过快，可以适当降低活性氧阳性对照的浓度。

（2）对于某些细胞，如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可以按照1∶2000～1∶5000

稀释DCFH-DA，使装载探针时DCFH-DA的浓度为2～5μmol/L。探针装载的时间也可以根据情况在15～60分钟内适当进行调整。

（3）活性氧阳性对照（Rosup）仅仅用于作为阳性对照的样品，并不是在每个样品中都需加入活性氧阳性对照。

活性氧检测试剂盒/Reactive Oxygen Species Assay Kit/ROS Assay Kit注意事项

1) 探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。

2) 探针装载完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的装载情况是否良好。DCF的激发光谱和发射光谱见上图。

3) 尽量缩短探针装载后到测定所用的时间（刺激时间除外），以减少各种可能的误差。

4）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
活性氧检测试剂盒/Reactive Oxygen Species Assay Kit/ROS Assay Kityb-1292 CHO/dhFr-(中国仓鼠二氢叶酸还原酶缺陷细胞)
yb-1293 Lec1(卵巢细胞)
yb-1294 293T/17 [HEK 293T/17] (人胚肾细胞)
yb-1295 AAV-293( 胚肾细胞 )
yb-1296 hFOB 1.19(SV40 转染成骨细胞)
yb-1297 CCD-1095Sk(皮肤细胞 )
yb-1298 Hs 578Bst(乳腺细胞)
yb-1299 NK-92(人恶性非霍奇金淋巴瘤患者的自然杀伤细胞)
yb-1300 NK-92MI(人恶性非霍奇金淋巴瘤患者的自然杀伤细胞)
yb-1301 HMy2.CIR(人B 淋巴母细胞)
yb-1302 OK(负鼠(opossum)肾细胞)
yb-1303 FO(骨髓瘤细胞)
yb-1304 RAW 264.7(单核巨噬细胞白血病)
yb-1305 P19(畸胎癌细胞)
yb-1306 C6(胶质瘤细胞)
yb-1307 RBL-2H3(白血病细胞)
yb-1308 SiHa(子宫颈癌细胞)
yb-1309 MG-63(骨肉瘤细胞)
yb-1310 HEC-1-B(子宫内膜腺癌细胞)
yb-1311 SW1353(骨肉瘤细胞)
yb-1312 ES-2(卵巢透明细胞癌细胞)
yb-1313 Saos-2(成骨肉瘤细胞)
yb-1314 MDA-MB-468(乳腺癌细胞)
yb-1315 SK-MES-1(肺鳞癌细胞)
yb-1316 MDA-MB-435S(乳腺癌细胞)
yb-1317 NCI-H661(大细胞肺癌细胞)
yb-1318 ZR-75-1(乳腺癌细胞)
yb-1319 NCI-H292(肺癌细胞（淋巴结转移）)
yb-1320 Hs 578T(乳腺癌细胞)
yb-1321 U-937(组织细胞淋巴瘤细胞)
yb-1322 CFPAC-1(胰腺癌细胞)
yb-1323 A3(淋巴细胞白血病细胞)
yb-1324 PANC-1(胰腺癌细胞)