巯基蛋白琼脂糖偶联树脂 SulfoLink Coupling

产品信息

产品名称	产品编号	规格	储存	价格（元）
SulfoLink Coupling Resin巯基蛋白琼脂糖偶联树脂	20511ES08	5ml	4℃	928.00
SulfoLink Coupling Resin 巯基蛋白琼脂糖偶联树脂	20511ES25	25ml	4℃	2388.00
SulfoLink Coupling Resin 巯基蛋白琼脂糖偶联树脂	20511ES60	100ml	4℃	8548.00

产品描述
SulfoLink Coupling Resin是一类预活化树脂，其纯化原理在于可以通过与巯基或者氨基的反应实现抗原的固定化，进而利用抗原抗体的特异性反应对免疫血清中的抗体进行高效纯化，是多克隆抗体生产中不可缺少的纯化介质。
产品性质

基质（Matrix）	4%琼脂糖
配体（Ligand）	碘|乙酸
孔径（Bead size）	45-165µm
载量（Capacity）	＞3mg IgG/ml 基质
最大流速（Flow velocitymax）	0.1Mpa,1bar
pH范围（pH range）	5-10
储存缓冲液（Buffer）	1M NaCl

运输和保存方法
冰袋运输。4℃保存。
注意事项
1）SulfoLink Coupling Resin使用前一定要充分颠倒若干次，使琼脂糖珠混合均匀。
2）所有操作过程中，样本需要在4℃或冰上操作。
3）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用方法
针对巯基和氨基的偶联条件有所差异，请分别进行选择。
1含巯基抗原的偶联流程
1.1 缓冲液准备
所用水和 Buffer 在使用之前建议用0.22 μm或0.45μm滤膜过滤。
偶联液：50 mMTris, 5 mM EDTA-Na, pH 8.5
封闭液：50 mMTris, 5 mM EDTA-Na, 50 mM L-半胱氨酸，pH 8.5
保护液：20 mM PBS，20%乙醇，pH 8.0
结合/洗杂液：20 mM PBS，pH 8.0
洗脱液：100 mM甘氨酸，pH 2.5-3.0
中和液：1 M Tris-HCl, pH 8.5
1.2 抗原准备
使用偶联液溶解抗原，制备成终浓度为 1-3 mg/ml 的抗原溶液。建议该溶液现用现配，储存时间过长会影响偶联效果。
【注】：①抗原样品使用前务必确保其巯基处于还原状态（可以使用 DTNB(Ellman's Reagent), Yeasen Cat#60306）检测自由巯基的含量）。如果巯基已经氧化，必须对抗原进行还原，一般推荐使用还原剂 TCEP（Tris(2-carboxyethyl)phosphine, YeasenCat# 20330），TCEP 溶液很稳定，可以选择性的、高效的打开抗原中的二硫键，并且不影响抗原与树脂的偶联反应，每毫克抗原中 TCEP 的添加量不超过12mg，具体使用量需要自行优化。
②如果使用 DTT 等含有巯基的还原剂，处理完样品必须要将还原剂去除，否则会影响抗原与树脂的偶联效率。
1.3抗原偶联
1）取适量SulfoLink Coupling Resin，加入到合适的重力柱中，靠重力流干保护液，用3倍柱体积的偶联液平衡树脂，待偶联液流干，再加入3倍柱体积的偶联液，重复操作 2遍。共使用9倍柱体积的偶联液。
2）关闭柱子的下端出口，加入等体积的含巯基的抗原，混匀，取出至合适的离心管中，置于28℃震荡孵育30min。
【注】：确保树脂充分悬浮起来，否则将大大影响偶联效率。
3）将上述反应体系取出，转移至重力柱中，流干其中溶液，并收集流出液，再用3倍柱体积的偶联液清洗树脂，合并两次流出液。
【注】：如有需要，可以使用Ellman’s Reagent 检测其中巯基含量，得出抗原残留量，从而计算偶联效率。
4）关闭柱子的下端出口，加入等体积的封闭液，混匀，转移至合适的离心管中，于28℃震荡孵育30min。
5）将上述反应体系取出，转移至重力柱中，流干其中的封闭液。
【注】：如果立即使用，可以参考【抗体纯化】操作。如果以后使用，可以用3倍柱体积的结合液清洗树脂，然后保存在等体积的保护液中，于 4℃冰箱保存。
1.4 抗体纯化
1）将偶联了抗原的树脂装入合适的层析柱，用5倍柱体积的结合液进行平衡，使填料处于与抗体更易结合环境中，一方面保护目标抗体，另一方面提高抗体结合效率。
2）将含有抗体的样品加到平衡好树脂中，为了保证抗体与树脂充分接触，提高目标抗体的回收率，可以控制上样流速在0.5-1 ml/min，并收集流出液。
3）用10-15倍柱体积的洗杂液进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，提高目的抗体的纯度，收集洗杂液。
4）使用5-10倍柱体积的洗脱液，收集洗脱组分，即目的抗体。
【注】：为了保持抗体活性，需要立即将洗脱组分透析至pH 7.0-8.0的缓冲液中，或者先加入1/10倍洗脱组分体积的中和液，将洗脱组分进行中和，再透析。
5）依次使用3倍柱体积的结合液和5倍柱体积的去离子水平衡树脂，最后再用5倍柱体积的保护液平衡，然后保存在等体积的保护液中，置于4℃保存，防止填料被细菌污染。

2 含氨基抗原偶联流程
2.1 缓冲液准备
所用水和 Buffer 在使用之前建议用 0.22µm或0.45µm滤膜过滤。
偶联液：0.1 M NaHCO₃，0.5 M NaCl，pH 8.5
封闭液：50 mMTris, 5 mM EDTA-Na, 50 mM L-半胱氨酸，pH 8.5
保护液：20 mM PBS，20%乙醇，pH 8.0
结合/洗杂液：20 mM PBS，pH 8.0
洗脱液：100 mM甘氨酸，pH 2.5-3.0
中和液：1 M Tris-HCl, pH 8.5
2.2抗原偶联
1）使用偶联液溶解抗原，制备成终浓度为5-10 mg/ml的抗原溶液。
2）取适量SulfoLink Coupling Resin，加入到合适的重力柱中，靠重力流干保护液，用3倍柱体积的偶联液平衡树脂，待偶联液流干，再加入3倍柱体积的偶联液，重复操作2遍。共使用9倍柱体积的偶联液。
3）关闭柱子的下端出口，加入等体积的含氨基的抗原，混匀，取出转移至合适的离心管中，置于 28℃震荡孵育3-5h，或者4℃震荡孵育过夜（12-15h）。
【注】：确保树脂充分悬浮起来，否则将大大影响偶联效率。
4）将上述反应体系取出，转移至重力柱中，收集流出液，再用3倍柱体积的偶联液清洗树脂，合并两次流出，待测试。
5）关闭柱子的下端出口，加入等体积的封闭液，混匀，取出转移至合适的离心管中，置于28℃震荡孵育30min。
6）将上述反应体系取出，转移至重力柱中，流干其中的封闭液。
【注】：如果暂不使用，可以用3倍柱体积的结合液清洗树脂，然后保存在等体积的保护液中，于4℃保存。
2.3 抗体纯化
1）将偶联了抗原的树脂装入合适的层析柱，用5倍柱体积的结合液进行平衡，使填料处于与抗体更易结合环境中，一方面保护目标抗体，另一方面提高抗体结合效率。
2）将含有抗体的样品加到平衡好树脂中，为了保证抗体与树脂充分接触，提高目标抗体的回收率，可以控制上样流速在0.5-1 ml/min，并收集流出液。
3）用10-15 倍柱体积的洗杂液进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，提高目的抗体的纯度，收集洗杂液。
4）使用5-10倍柱体积的洗脱液，收集洗脱组分，即目的抗体。
【注】：为了保持抗体活性，需要立即将洗脱组分透析至pH7.0-8.0的缓冲液中，或者先加入1/10倍洗脱组分体积的中和液，将洗脱组分进行中和，再透析。
5）依次使用3倍柱体积的结合液和5倍柱体积的去离子水平衡树脂，最后再用5倍柱体积的保护液平衡，然后保存在等体积的保护液中，置于4℃保存，防止填料被细菌污染。
3 SDS-PAGE 检测
将纯化抗体样品得到的流出组分、洗杂组分和洗脱组分以及原始含抗体样品使用SDS-PAGE检测纯化效果。

4 问题与解决方案

出现问题	原因	推荐解决方案
柱子流速低	筛板被堵塞	清洗或更换筛板
	样品或填料中有气泡	轻轻搅拌填料或敲击层析柱去除气泡
偶联液中蛋白或多肽沉淀	蛋白或多肽不溶	偶联液中加入＜30%的DMSO或DMF或6M盐酸胍促进样品溶解
偶联效率低	样品无巯基，被氧化	加入DTT或TCEP后立即交联
洗脱组分纯度低	树脂没有彻底清洗	增加结合/洗杂液体积

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产品编号	产品名称	规格	价格（元）
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