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- HL7135
- 2025年10月15日
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英文名称：
规格：25g
结晶紫产品说明与用途：
结晶紫使用操作规程：
目的：建立营养琼脂培养基配制使用操作规程。
范围：本操作规程适用于营养琼产品脂培养基的配制使用。
职责：质检室质检员负责本操作规程的执行，质保室质监员负责本操作规程的监督检查。
结晶紫实验内容：
1．仪器与试剂：
1.1.托盘天平、消毒锅、电实验冰箱、1000ml三角瓶、500ml量筒、玻璃棒、棉塞、牛皮纸、线绳、培养皿。
1.2.蒸馏水、营养琼脂、75%酒精。
2.操作方法
2.1.称取营养琼脂17克，于1000ml三角瓶内，加入500ml纯化水，充分搅拌后，塞上棉塞，用牛皮纸包好，扎紧瓶口。
2.2.置消毒锅内，于115℃高压灭菌30分钟，取出放置至室温后，放入实验冰箱，备用（实验冰箱温度控制在1－4℃）。
2.3.使用时从实验冰箱取出，放置室温后，置水浴中加热，使融，全部融化后取出，放置约45℃时使用。
2.4.使用时，用75%乙醇擦瓶子外围，打开牛皮纸包扎外壳，在火焰附近慢慢旋下棉塞，左手拿培养皿，右手拿三角瓶，慢慢倾倒至培养皿中，每皿注入约
15ml完毕后，将棉塞在火焰上方烧烤数秒，立马塞入瓶口，包上牛皮纸外层，用线绳扎好，留下次使用。（此瓶培养基只允许使用两次，且每次首先倾注一个空白平皿作为对照培养）。
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文献和实验孔 6 个， 3 个阳性对照孔各加 0.1ml 含 4 μ g TNF 的 RPMI-1640 培养液， 3 个阴性对照孔各加 100 μ l RPMI-1640 培养液。继续培养 18 ～ 24 小时。 3． 甩去培养液，用 PBS 小心洗涤一次，每孔加 0.1ml 10 ％甲醇溶液固定细胞 30 秒钟。 4． 吸去甲醇溶液，每孔加 0.1ml 结晶紫染液，室温中放置 20 分钟。 5． 轻轻甩去染色液，用蒸馏水洗涤各孔，将培养板倒置于吸水纸上吸干水分。自然干燥或 37 ℃烘干
TNF的RPMI-1640培养液，3个阴性对照孔各加100μl RPMI-1640培养液。继续培养18～24小时。 3．甩去培养液，用PBS 小心洗涤一次，每孔加0.1ml 10％甲醇溶液固定细胞30秒钟。 4．吸去甲醇溶液，每孔加0.1ml结晶紫染液，室温中放置20分钟。 5．轻轻甩去染色液，用蒸馏水洗涤各孔，将培养板倒置于吸水纸上吸干水分。自然干燥或37℃烘干。此板可以在室温中长期保存。 6．测定前，每孔加0.1ml 33％醋酸脱色，充分振荡后在570
～100倍。利用染料结晶紫或MTT可使活细胞染色，再用脱色液将染料脱出，测定其OD值，即可反应细胞的存活状态或TNF对L929细胞的杀伤率，通过计算细胞死亡率，并与sTNF标准品对照，即可检测待测样品sTNF活性单位。 二、材料和试剂 1. L929细胞株（存活率应＞95%） 2. TNF标准品：作倍比稀释（100 U/ml～0.1 U/ml）。 3. 待测样品：作倍比稀释至少6个不同稀释度。 4. 0.25%胰蛋白酶 5. RPMI-1640培养液及PBS
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