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上海笃玛生物科技有限公司
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血清、血浆、尿液、胸腹水、脑脊液、细胞培养上清、组织匀浆等
48T/96T
规格: | 48T | 产品价格: | ¥1080.0 |
---|---|---|---|
规格: | 96T | 产品价格: | ¥1896.0 |
ELISA的评估
ELISA Kit的多指标决定了产品质量的优劣,优秀的试剂盒需要对如下6大项指标进行测定评估,分析如下:
1、准确性
ELISA Kit的多指标决定了产品质量的优劣,优秀的试剂盒需要对如下6大项指标进行测定评估,分析如下:
a.回收率:测定试剂盒对数据真实性的校准,过高或偏低会产生加样和假性性的失准数据。
b.线性:测定试剂盒稀释液与样本微环境的的准确性,过高或偏低均会出现测定的偏差。
2、精确度
a.板内精确度:评价单次实验中,同一个已知浓度不同复孔的差异。
b.板间精确度:评价同一样本,多次实验的差异。
3、精密度
检测限:能显著区分空白信号的最小信号值对应的浓度,用于评估试剂盒的灵敏度,值越低试剂盒灵敏度越高。
4、特异性
a.交叉反应:评判特异性,不同分子与试剂盒抗体结合能力,交叉反应越大,特异性越差。
b.抗干扰能力:同源物的干扰,内源性物质对检测系统的干扰。
5.天然样本检测性
对天然样本及合适的样本类型检测分析。对天然样本类型确定,避免假阳性或假阴性结果。
6、稳定性
试剂盒时效性和稳定性是对指标检测的重要保障。稳定性越高,试剂盒存储时间越久。
ELISA的原理
ELISA原理是将抗原或抗体包被在固相载体上,利用抗原抗体特异性结合,检测过程中,通常使用洗板的方式去除非结合物,最终酶促反应后的底物的颜色,对样本中蛋白进行定性与定量。
不按说明书操作会造成的后果
每一个试剂盒里都会有对应的说明书,注意事项里大多都会提到“实验严格按照说明书的操作进行”。为什么要严格按照说明书操作?为了更完整的回答这个问题,需要先回顾一下ELISA各种方法的原理。
根据试剂的来源和标本的性状及检测的具体条件,可设计出不同类型的检测方法。大致分为以下几类:
1.双抗体夹心法测抗原
2.双抗原夹心法测抗体
3.竞争法测抗原
4.间接法测抗体
总结如果不按说明书操作可能会出现的不满意结果。
A. 先说最严重的操作错误,看错或压根不看试剂盒配套说明书,不按操作步骤加样。比如把竞争法的试剂盒当作双抗体夹心法来做,导致的结果就是整板显示很强的蓝色,无任何梯度。
B. 混用别的试剂盒里的试剂。不同厂家或者相同厂家的不同试剂盒,所含的试剂成分很可能是不一样的,混用导致的结果是,浪费珍贵的样本,样品的回收率达不到预期值,如果混用不同试剂盒的酶复合物,会导致显色过弱或过强,因为每种试剂盒所用酶复合物效价可能不一样。
C. 不看文献或者不做预实验。比如某个试剂盒按照其灵敏度范围和文献报道推算样本应该1:10稀释,结果稀释成1:1000,导致的结果是显色过弱,结果不可用。
D. 不校准移液器及培养箱的温度湿度。导致工作试剂浓度不准确,孵育温度不合适,实验带来误差。
E. 洗涤不充分,每孔洗液加样过少,或者残留。导致的结果是显色过快,同时背景较高。
F. 手洗板时所用枪头没有悬空加入洗液,导致洗液污染,整个实验失败。
G. 剩余酶标板条未及时放入干燥袋,导致酶标板受潮,下一次再做时,显色过弱或污染,CV值过高。
ELISA常见主要试剂
1. 抗体:单抗特异性强,多抗结合性高,试剂盒需要高效的配对。
2. 2.抗原:大多为重组蛋白,细胞因子和待测样本,高效标准品需NIBSC/WHO校准。
3. 3.显色作用体系:首先辣根过氧化物酶(HRP)与常见底物TMB和OPD均可形成显色体系,再者碱性磷酸酶(AP)的底物为对-磷酸酯可形成黄色底物,还有葡萄糖氧化酶(GOD)的葡萄糖氧化酶法形成特殊显色,最后β-D-半乳糖苷(β-D-Gal)的底物为4-甲基伞酮基β-D半-乳糖苷(4MUG)可生成高强度荧光。
ELISA的类型
根据试剂的来源和样本的情况以及检测的具体条件,可设计出各种不同类型的检测方法,按照原理及操作,市面的方法有:
1.间接法ELISA
是检测抗体的方法,原理为利用酶标记的二抗以检测已与固相结合的受检抗体,显色测定。优势在于待测一抗无需标记快速便捷。直接法ELISA与间接法ELISA相似,区别在于一抗酶标,检测孵育也以抗原为主,但直接法ELISA的灵敏度有限,需权衡使用。
2.夹心法ELISA
又分为双抗原夹心法和双抗体夹心法ELISA,原理相似,用于检测抗体或抗原含量。以双抗体夹心法为例,捕获抗体包被在固相载体上,加入抗原或待测样本结合,后加入的检测抗体结合在抗原上,形成三明治夹心形式。双抗夹心法是市面最常见与方便分析的方法。
3.竞争法ELISA
小分子抗原与半抗原的检测方法常用竞争法ELISA,待检样本中抗原越多,被结合的酶标抗原的量会减少,彼此形成竞争负相关体系,显色物质也就越少,根据显色物质的比例可拟合得到待测抗原含量。
4.其他方法
a.免疫抑制法测ELISA:固相包被抗原,被检样本对底物显色的抑制程度与样本中所含抗原的量成正比,二者之差为待测抗原含量,原理类似与竞争法ELISA。
b.阻断ELISA:目的检测特异性抗体,也称为竞争ELISA,原理为固相包被抗原,待测样本与一抗酶标竞争孵育,待检样本中抗体越多,显色越浅,反则反之。非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒中涉及该法。
c.此外有用于检测IgM抗体的抗体捕捉ELISA,有固相载体改变的Dot-ELISA(硝酸纤维素膜)和C-ELISA(涤纶布),还有技术分类的TRFIA和多因子检测等。
ELISA的评估
ELISA Kit的多指标决定了产品质量的优劣,优秀的试剂盒需要对如下6大项指标进行测定评估,分析如下:
1、准确性
ELISA Kit的多指标决定了产品质量的优劣,优秀的试剂盒需要对如下6大项指标进行测定评估,分析如下:
a.回收率:测定试剂盒对数据真实性的校准,过高或偏低会产生加样和假性性的失准数据。
b.线性:测定试剂盒稀释液与样本微环境的的准确性,过高或偏低均会出现测定的偏差。
2、精确度
a.板内精确度:评价单次实验中,同一个已知浓度不同复孔的差异。
b.板间精确度:评价同一样本,多次实验的差异。
3、精密度
检测限:能显著区分空白信号的最小信号值对应的浓度,用于评估试剂盒的灵敏度,值越低试剂盒灵敏度越高。
4、特异性
a.交叉反应:评判特异性,不同分子与试剂盒抗体结合能力,交叉反应越大,特异性越差。
b.抗干扰能力:同源物的干扰,内源性物质对检测系统的干扰。
5.天然样本检测性
对天然样本及合适的样本类型检测分析。对天然样本类型确定,避免假阳性或假阴性结果。
6、稳定性
试剂盒时效性和稳定性是对指标检测的重要保障。稳定性越高,试剂盒存储时间越久。
ELISA的应用
ELISA技术是特定靶标蛋白质定量的金标准,提供快速,稳定且易于分析的结果。可以对生物大分子/小分子的定量,对亲和力测定评价或者筛选,还可对重组蛋白或细胞因子进行活性比对分析等运用。常应用于细胞因子,趋化因子,生长因子等检测,同时应用于癌症、干细胞、免疫学、神经学和信号转导等研究领域的靶标。
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离开了细胞培养皿,还能愉快做实验吗
培育皿一般用玻璃或塑料制成,是培育微生物或细胞培育的常用试验耗材,一般玻璃的能够用于植物资料、微生物培育和动物细胞的贴壁培育也可能用到。塑料的可能是聚乙烯资料的,合适试验室接种、划线、分离细菌的操作,能够用于植物资料的培育。培育皿易碎,在清洗和运用时要当心轻拿轻放,运用完后要及时清洗洁净,存放在安全、固定的方位。
培育皿的清洁:
1、浸泡:新的或用过的玻璃器皿要先用清水浸泡,软化和溶解附着物。新玻璃器皿运用前得先用自来水简略冲刷,然后用5%盐酸浸泡过夜;用过的玻璃器皿往往附有许多蛋白质和油脂,干枯后不易冲刷掉,故用后应立即浸入清水中备冲刷。
2、冲刷:将浸泡后的玻璃器皿放到洗刷剂水中,用软毛刷重复冲刷。不要留死角,并避免损坏器皿外表的光洁度。将冲刷洁净的玻璃器皿洗净、晾干,备浸酸。
3、.浸酸:浸酸是将上述器皿浸泡到清洁液中,又称酸液,通过酸液的强氧化作用铲除器皿外表的可能残留物质。浸酸不该少于六小时,一般过夜或更长。放取器皿要当心。
4、冲刷:冲刷和浸酸后的器皿都必须用水充沛冲刷,浸酸后器皿是否冲刷的洁净,直接影响到细胞培育的胜败。手艺洗刷浸酸后的器皿,每件器皿至少要重复“灌水-倒空”15次以上,最后用重蒸水浸洗2-3次,晾干或烘干后包装备用。
培育皿运用留意事宜:
1、运用前通过清洁消毒,培育皿清洁与否对作业影响较大,可影响培育基的酸碱度,若有某些化学药品的存在,会按捺细菌成长。
2、新购的培育皿应先用热水冲刷,再置于质量分数为1%或2%的盐酸溶液中浸泡数小时,使游离碱性物质除掉,再用蒸馏水冲刷2次。
3、若要培育细菌,再用高压蒸气(一般6.8*10的5次方Pa高压蒸气),120℃的温度下30min灭菌,置室温中枯燥,或用干热灭菌,就是将培育皿置于烘箱内,温度控制在120℃左右的情况下保持2h,即可杀死细菌的胞牙。
4、通过消毒的培育皿才干接种培育运用。
AP的底物
AP为磷酸酯酶,一般采用对磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate,p-作为底物,可制成片剂,使用方便。产物为黄色的对硝基酚,在405nm波长处有吸收峰。用NaOH终止酶反应后,黄色可稳定一时间。AP也有发荧光底物(磷酸4-甲基伞酮),可用于ELISA作荧光测定,敏感度较高于用显色底物的比色法。
2,洗涤液
在板式ELISA中,常用的稀释液为含0.05%吐温20磷酸缓冲盐水。
3, 酶反应终止液
常用的HRP反应终止液为硫酸,其浓度按加量及比色液的最终体积而异,在板式ELISA中一般采用2mol/L。
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