步骤 1. Transwell小室准备 1)无基质胶Transwell小室制备 A. 包被基底膜: A. Matrigel (50mg/L)按1:8稀释,无血清培养基作为稀释液 B. 取适量加入Transwell小室中(24孔板transwell小室加100 ul),4℃操作。 C. 37℃培养箱中,孵育4-5h(>5h);出现“白色层”时,说明已经变为固态。
2)有基质胶Transwell小室制备 A. 小室放入培养板中,上室加入300µl预温的无血清培养基 B. 室温下静置15-30min,使基质胶再水化 C. 再吸去剩余培养液。
4. 结果统计 检测穿过的细胞数有两种方法: 1 ) 直接计数法 “贴壁”细胞计数: “贴壁”是指细胞穿过膜后,可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去。 通过给细胞染色,可在镜下计数细胞 A. 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞 B. 染色:常用的0.1%结晶紫染色。 优点:(1) 不需固定细胞,直接染色即可。 (2) 配制简单方便。 (3) 可以用33%醋酸脱色,测量洗脱液OD570值,间接反映细胞数 注意,染色前要将膜风干,否则可能会染不上。 C. 细胞计数: (1) 显微镜进行观察和拍照 (2) 取3-5个视野计数细胞个数
2) 间接计数法 用于穿过细胞过多,而无法通过计数获得准确的细胞数。 MTT法 A. 棉签擦去基质胶和上室内的细胞 B. 24孔板中加入500µl含0.5mg/ml MTT的完全培养基,将小室浸没于其中,置于37℃2-4h后取出。 C. 24孔板中加入500µl DMSO,将小室浸没于其中,振荡结晶充分溶解。 D. 取出小室,测所得DMSO的OD值。 结晶紫检测 A. 棉签擦去基质胶和上室内的细胞 B. (可选)甲醛固定30分钟,室温 B. 24孔板中加入500µl 0.1%结晶紫溶液,将小室浸没于其中,室温放置20分钟 C. 24孔板中加入500µl 33%醋酸,将小室浸没于其中,脱色。 D. 取出小室,测量洗脱液OD570值。 优点:染色和脱色的过程并不影响膜上细胞,在脱色后还可重新染色。