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HLA高低分辨分型(A,B,C
大量
SSP HLA Typing
上海长荣生物
上海长荣生物科技有限公司 专业提供DNA/RNA快速提取试剂、HLA高低分辨分型(A,B,C,DR,DQ),B27位点检测及分子生物学耗材试剂。愿意真诚为您服务!请致电:18930640599 mail:zjt725@139.com
由美国德州生物基因有限公司(Texas BioGene,Inc)生产出新型新型HLA- ABDR SSP Morgan™试剂盒,该试剂根据亚洲人种特点而独特设计,可用于HLA I类A,B位点和Ⅱ类DR位点等位基因低分辨分型检测。试剂独特的96套引物设计,不仅可以扩增涵盖所有Tissue Antigen(International Nomenclature Committee of WHO)中所包括所有等位基因,同时还可以扩增自1996年到2009年Tissue Antigen 杂志中发布的所有新等位基因。SSP Morgan TM 试剂具有可靠、简便以及重复性高等显著特点。
1)Morgan TM System HLA-ABDR 操作手册
一,试剂盒组成:1.试剂分为1×96、2×96、4×96四个类型,每个test 含有96个引物。2.8M buffer----612μl/管。注意:使用前请在-20度保存3.热循环反应封板纸。4.引物特异性列表、判读表。5.新版本判读软件光盘,光盘含有在Morgan TM系统中所包括的所有试剂的分析软件没有提供的原材料、试剂及仪器1.Taq 酶。2.双蒸水。3.96孔V型板用热循环仪-——本试剂盒是按照Perkins Elmer 9700 PCR仪标准设计的。4.0.5×TBE电泳缓冲溶液。5.电泳系统(德克萨斯生物公司提供凝胶系统)。6.DNA 分子量标。7.电泳电源。二,DNA样品准备一切可以分离得到高质量DNA样品的方法均可以应用。(强烈推荐使用本公司生产的BioGene-FastTM以及ExpuzeTM DNA 提取试剂盒)1.血样应该收集到用EDTA或者ACD处理过的抗凝管中。2.提取DNA样品存度要求:A260/A280比值应大于1.65凝胶电泳在分子量略大于10kb左右在出现清晰的一条带。3.DNA样品浓度要求在10-80ng/μl(Morgan TM系统可以允许DNA浓度在较大的范围内变化)。三,PCR 准备1.将配型试剂,8M buffer,DNA样品,Taq酶等相关试剂放在架子上。2.严格按照以下步骤配置PCR反应液容量(ul/孔)总数(ul)DNA(10-30ng/ul)2.02048M buffer6.0612Taq酶(5u/ul)0.044.5总数8.0820.5在8M buffer 小管中加入浓度位5U/μl Taq酶4.5μl,混匀,在每个test的第一孔加入8μl作为质控。 加入204μl DNA样品到上面试管中(8M buffer /Taq 酶),充分混匀。3.在剩下的各孔中加入8μl上述混合液4.用耐热封口纸封好试剂板。5.压上热垫,进行PCR扩增四,扩增程序本公司DNA配型试剂是按照Perkin ElmerAmp 9600和9700标准设计的 。每次扩增时间大约1小时25分钟。SegmentCycle numberTemperatureTime1112℃5 min2196℃2.5 min31095℃20 sec65℃60 sec42295℃15 sec62℃50 sec72℃30 sec514 ℃Until removed
五,胶电泳1.用DNA级的琼脂糖和0.5× TBE缓冲液配置浓度为2.5%的琼脂糖凝胶。当应用德克萨斯凝胶系统时,每块96孔胶需要70 ml 2.5%琼脂糖溶液。2.按照次序依次每孔加入6μl PCR 扩增产物(#1 空用黑色的小点标记)。3. 凝胶在每厘米10伏特电压下电泳,知道红色的色带离加样孔0.7-1.0厘米,电泳结束。4. 将凝胶取出放在紫外成像系统中。六,阅读凝胶1.每条电泳道(除了第一条电泳道)都会显示大小位600 bp 的内部质控带2.应用计算机软件或者判读表对阳性条带进行配型,以得到DNA样品的HLA型号。3.污染监测孔(第1孔)中出现阳性特异带,结果无效。4.如果内部指控以及特意性条带均没有出现表明反应失败。5.非特异性条带,出现的条带大小和标准不一致,出现的原因是由于不明原因的非特异性扩增。去掉这些条带,再进行判读。常出现问题以及解决方法1.没有扩增出条带或条带不清晰。可能的原因以及相关的解决方法:a.肝素影响:用Expuze TM 试剂盒分离提取DNAb.DNA质量不高:用Expuze TM 试剂盒纯化DNA,或者用该试剂盒重新提取DNA样品c.DNA样品量不够:增加DNA量d.抑制物的存在:将DNA样品加热到95℃ 5分钟,然后进行PCR反应或者是再次分离DNAe.Tap酶活力不对:联系Taq酶供应商,或者咨询德克萨斯生物科技有限公司以便获得好品牌的Taq酶。2.非特异性阳性条带的出现。可能的原因以及相关的解决方法:a.过量的DNA或者过量的Taq酶:重新测定DNA浓度并调整DNA的加样量;小心精确的量取DNA酶。b.不准确的热循环温度:校对热循环温度。c.DNA被别的DNA污染:从原来的血浆中重新分离DNA样品。3.非特异性阴性条带的出现。可能的原因以及相关的解决方法:a.不准确的热循环温度:校对热循环温度。b.DNA、ddH2O以及Taq酶混合不均匀:在加入反应孔前充分的混合。
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