T4多聚核苷酸激酶 (缺失3′磷酸酶活性)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

T4多聚核苷酸激酶能够催化磷酸在ATP的γ-位和寡核苷酸链(双链或单链DNA或RNA)的5′-羟基末端以及3′-单磷酸核苷间进行转移和交换(1-5)。T4多聚核苷酸激酶 (NEB #M0201) 还具有3′磷酸酶活性，将3′-磷酸基团从寡核苷酸的3′磷酸末端、脱氧3′-单磷酸核苷和脱氧3′-二磷酸核苷上水解掉(1)。经修饰后的酶 (NEB #M0236) 具有所有激酶的活性，但是缺失了3′磷酸酶活性 (6,7) 。

重组E. coli 菌株，含有T4多聚核苷酸激酶或修饰的T4多聚核苷酸激酶基因。

• 寡核苷酸5′末端的磷酸化，以便进行连接反应。
• DN A 或RN A的末端标记，用作探针和进行DN A 测序^{( 2 )} 。
• 除去3′磷酸基团(T4多聚核苷酸激酶NEB#M0201)⁽³⁾ 。

1X T4 PNK反应缓冲液[70 mM Tris-HCl (pH7.6) , 10 mM MgCl₂ , 5 mM DTT]。37°C温育。

T4多聚核苷酸激酶需要ATP才能发挥活性，但是为了适用于放射性标记反应，在随酶提供的反应缓冲液中不含ATP。

一般来说，进行激酶反应之后是连接反应。在这种情况下，T4多聚核苷酸激酶反应在连接酶反应缓冲液中37°C温育30分钟即可。反应后的产物可直接进行连接，也不需要热失活，如果连接时需要保持其他DNA片段的去磷酸化状态，则需要在连接前热失活T4多聚核苷酸激酶。

激酶在新鲜缓冲液中表现最适酶活力(在旧缓冲液中，由于DTT氧化而造成的实际DTT含量的减少会降低酶活力) 。

50 μl反应体系中 (1X T4 多聚核苷酸激酶反应缓冲液, 50 pmol of γ- ^[32] P ATP) ，加入20单位的酶37°C温育30分钟可催化1–50 pmol的5′磷酸化。^[33] P ATP 可代替^[32] P ATP作标记反应。

CTP, GTP, TTP, UTP, dATP 及 dTTP 均可替代ATP (1)作为磷酸供体。

非放射性磷酸化反应：在50 μl 反应体系中用1XT4多聚核苷酸激酶反应缓冲液，1 mM ATP和10单位的酶37°C温育30分钟能催化300 pmol的5′末端磷酸化。含1 mM ATP的1X T4 DNA连接酶缓冲液在非放射性磷酸化反应中可以代替1X T4多聚核苷酸激酶反应缓冲液应用，在此缓冲液中T4多聚核苷酸激酶也有100%的活力。

要提高5′平滑末端或5′凹陷末端的磷酸化效率，可在加T4多聚核苷酸激酶前，先将DNA溶液于
70°C加热5分钟，然后冰上冷却，或者加入5% (W/V) 的PEG-8,000 (2) 。

当在反应缓冲液中添加以下物质时，对酶有不同程度的抑制效应：
50 mM NaCl - 无抑制
100 mM NaCl - 30%的抑制
150 mM NaCl - 50%的抑制
7 mM 磷酸盐- 50%的抑制
7 mM 硫酸铵 - 75%的抑制

由于T4多聚核苷酸激酶可被铵离子所抑制，所以磷酸化步骤前，DNA不要在含铵离子的溶液中沉淀。可以用交换反应的方法省略末端标记反应前的去磷酸化反应，尽管这样可能会降低标记的特异性(4)。在反应缓冲液中加入终浓度为100 μM ADP可以达到足够的掺入量。当使用参考文献(2)中的缓冲液时也可以通过交换反应达到较高的掺入水平。

提高ATP浓度可以标记DNA缺口，但不能标记缺刻。

无核酸内、外切酶、磷酸酶和RNA酶活性的污染。每批产品均通过检测5′末端标记检测以确保[³² P]基团的最大转移效率。

1单位指1个Richardson单位指37°C条件下，30分钟内催化1 nmole酸不溶性[ ^[32] P]掺入所需要的酶量。

1XT4多聚核苷酸激酶反应缓冲液，66 μM [γ-^[32] P] ATP (5X10⁶ cpm/ μmol) , 0.26 mM 5′-末端羟基化的鲑鱼精DNA (1) 。

10,000 units/ml。

50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.4) , 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.1 µM ATP 和50%甘油。-20°C贮存。

65°C 20分钟。
在50 μl T4多聚核苷酸激酶反应缓冲液体系中，37°C温育30分钟，γ-磷酸基团从ATP转移至d(T)₈ 的5′羟基末端，结果显示20单位酶量可使>90%的磷酸基团转移。[ATP与d (T) ₈ 比例是1:1，量为50 pmol]。

(1) Richardson, C.C. (1981). In P.D. Boyer (Ed.), The Enzymes , Vol. 14, (pp. 299–314). San Diego: Academic Press.
(2) Sambrook, J. et al. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual , (2nd ed.), (pp 10.59–10.67, 11.31–11.33). Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
(3) Cameron, V. and Uhlenbeck, O.C. (1977) Biochemistry , 16, 5120–5126.
(4) Berkner, K.L. and Folk, W.R. (1977) J. Biol. Chem ., 252, 3176–3184.
(5) Soltis, D.A. and Uhlenbeck, O.C. (1982) J. Biol. Chem ., 257, 11332–11339.
(6) Wang, L.K. and Human, S. (2001) J. Biol. Chem ., 276, 26868–26874.
(7) Wang, L.K. and Shuman, S. (2002) Nucl. Acids Res ., 30, 1073–1080.