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文献和实验。(注意:进样及清洗过程中手不要触及针头及注射器内壁,以防止引入污染) 2、用盛去离子水的洗瓶将进样口清洗2-3次。 3、将阀打到“进样”位置,用注射器各吸取1-2ml去离子水、样品依次注入将定量环清洗3次(注意:注射器中不能有气泡)。再吸取1-2ml(一般取1.0ml)样品注入,迅速将阀打至“分析”位置(注意动作要快,在1s内完成),同时按动“启动”按钮采集信号或仪器开始自动采集信号,并分析样品。 4、样品出峰完毕,点击“手动停止”按钮或F10或到工作站中‘采集
加药,或两小时,或半天时间,但我们常在前一天下午铺板,次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个,否则难以反应真实情况3.5%CO2,37℃孵育16-48小时,倒置显微镜下观察。4.每孔加入20ulMTT溶液(5mg/ml,即0.5%MTT),继续培养4h。若药物与MTT能够反应,可先离心后弃去培养液,小心用PBS冲2-3遍后,再加入含MTT的培养液。5.终止培养,小心吸去孔内培养液。6.每孔加入150ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解。在酶联
下 12000rpm 离心 15 min。收集蛋白上清,取少许裂解液用于后续检测各蛋白表达情况。剩余的裂解液加入 Anti-Cdc37,4℃ 缓慢摇晃孵育过夜。用适量裂解缓冲液预处理 ProteinA+G,20uL/管加入各抗体孵育过夜的细胞裂解液中,4℃ 缓慢摇晃孵育 2~4 h。免疫沉淀反应后,4℃,3000rpm,3 min,小心吸取上清,琼脂糖珠用 1 mL 裂解液冲洗 3-4 次,最后加入 15uL 2*SDS 上样缓冲液,100℃,5 min。Laemmli-SDS-PAGE电泳:电泳时根据情况
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