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文献和实验【旧贴整理】花了2星期系统归纳关于PCR的各位老师旧帖,与大家分享 --PCR
把酶放到最后加,否则他们有可能把引物都折磨得面目全非。2》、混合加样若做多管的PCR,可先加一起,再用枪分取比如要做n管,就把除模板之外的其他部分按照n+1份配好,然后再分装,如:10 x buffer 5uldNTP 4ul引物1 1ul引物2 1ultaq酶 1ulddw 34ul模板 2ul共有9个模板,就把除模板外的其他成分乘10,即buffer50ul,dNTP 40ul ,引物1 10ul,引物2 10ul,taq酶10ul,ddw 340ul,加到一个离心管中,加盖,用力振荡使混匀
)。 (10)95%乙醇。 (11)0.5%冰乙酸。 (12)Sigmacote (Sigma CAT. #SL-2)。 五、操作步骤: 成功地使用银染测序系统需要对提供的操作方法进行仔细考虑。银染不如放射性检测法灵敏,而需要更多的模板量,此外,也不可能通过延长X-光胶片曝光时间的方法增加信号强度。因此,请使用推荐的DNA 模板量,每次均使用所提供的对照检查系统的可靠性,并且注意如下几点: (1) DNA 的浓度和纯度必须经过琼脂糖凝胶电泳或荧光法测定,样品应
制备的凝胶可能撕裂或变得松驰。 2、凝胶的制备: (1)玻璃板经粘合硅胶和Sigmacote处理后,即可固定玻璃板。该方法是用0.2mm或0.4mm厚的边条置于玻璃板左右两侧,将另一块玻璃板压于其上。在长玻璃板的一侧插入鲨鱼齿梳平的一面边缘,用夹子固定住。 (2)根据所需要的凝胶浓度,按下表制备测序凝胶,一般6%-8%的胶浓度可获得较好的结果。配制过程中,先用适量双蒸水溶解尿素,再加入Acr&Bis和10×TBE缓冲液,再用双蒸水调终体积至99.2ml,并用0.45mm的滤膜过滤,然后加
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