琼脂糖凝胶亲和层析介质 rProtein A

rProtein A Beads
货号：R8290
规格：5ml
保存：2-8℃
产品介绍：
Protein A是一种分离自金黄色葡萄球菌的细胞壁蛋白，主要通过Fc 片段结合哺乳动物IgG，但是不与狗lgG 结合，不结合人lgM、lgD 和IgA。蛋白A与蛋白G不同来源及亚类的免疫球蛋白结合能力丌一样，具体见表。天然Protein A有五个IgG 结合区域和一些未知功能的区域，重组protein A去除了与白蛋白及细胞表面结合位点，只含有五个IgG结合区域，减少了非特异性吸附。
rProtein A Beads 产品性能：

指标	性能
基质	4%琼脂糖微球
配体	重组蛋白A
载量	>40mg人IgG/ml介质
粒径(μm)	45-165
最大流速	0.1MPa,1bar
pH稳定范围	3-10
储存缓冲液	含20%乙醇的1×PBS
储存温度	2-8°C

ProteinA和ProteinG对不同抗体的结合能力：

种属	亚型	Protein A	Protein G
Human	IgA	varible	—
	IgD	—	—
	IgE	—	—
	IgG1	++++	++++
	IgG2	++++	++++
	IgG3	—	++++
	IgG4	++++	++++
	IgM	varible	—
Avianeggyolk	IgY	—	—
Cow		++	++++
Dog		++	+
Goat		—	++
Guineapig	IgG1	++++	++
	IgG2	++++	++
Hamster		+	++
Horse	TotalIgG	++	++++
Koala		—	+
Liama		—	+
Monkey(rhesus)		++++	++++
Mouse	IgG1	+	++++
	IgG2a	++++	++++
	IgG2b	+++	+++
	IgG3	++	+++
	IgM	variable	—
Pig		+++	+++
Rabbit	TotalIgG	++++	+++
Rat	IgG1	—	+
	IgG2a	—	++++
	IgG2b	—	++
	IgG3	+	++
Sheep	TotalIgG	+/-	++

++++=结合能力强；++=结合能力中等；—=结合能力弱或没有结合
纯化流程：
1、Buffer 的准备
所用水和Buffer在使用之前建议用0.22μm或0.45μm滤膜过滤。
结合/ 洗杂Buffer: 0.15MNaCl，20mMNa₂HPO₄，pH7.0
洗脱Buffer: 0.1M甘氨酸，pH3.0
中和液： 1MTris-HCl，pH8.5
2、样品准备
上柱之前要确保样品溶液有合适的离子强度和pH值，可以用结合/洗杂缓冲液对血清样品、腹水或细胞培养液稀释，或者样品用结合/洗杂缓冲液透析。
样品在上样前建议离心或用0.22μm或0.45μm滤膜过滤，减少杂质，提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。
3、样品纯化
1)将 rProtein A Beads 装入合适的层析柱，层析用5倍柱体积的结合Buffer进行平衡，使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，起到保护蛋白的作用。
2)将样品加到平衡好的 rProtein A Beads 中（保证目的蛋白与rProtein A Beads 充分接触，提高目的蛋白的回收率），收集流出液。
3)用10-15倍柱体积的洗杂Buffer进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。
4)使用5-10倍柱体积的洗脱Buffer，收集洗脱液，即目的蛋白组分。
5)依次使用3倍柱体积的结合Buffer和5倍柱体积的去离子水平衡填料，最后再用5倍柱体积的20%的乙醇平衡，然后保存在等体积的20%的乙醇中，置于4度保存，防止填料被细菌污染。
4、SDS-PAGE检测
将使用纯化产品得到的样品（包括流出组分、洗杂组分和洗脱组分）以及原始样品使用SDS-PAGE检测纯化效果。
填料清洗
rProtein A Beads 可以重复使用而无需再生，但随着一些变性物质的沉淀和蛋白的聚集，往往造成流速和结合载量都下降，严重影响柱子的性能，这时需要对树脂进行清洗。
去除一些沉淀或变性物质
用2倍柱体积的6M盐酸胍溶液进行清洗，然后立即用5倍柱体积的PBS,pH7.4清洗。
去除一些疏水性吸附造成的非特异性吸附物质
用3-4倍柱体积的70%乙醇或2倍柱体积的1%TritonX-100清洗，然后然后立即用5倍柱体积的PBS,pH7.4清洗。
问题及解决方案

	原因分析	推荐解决方案
柱子反压过高	筛板被堵塞	清洗或更换筛板
	填料被堵塞	按照填料清洗部分进行树脂清洗
		裂解液中含有微小的固体颗粒，建议上柱前使用滤膜(0.22or0.45μm)过滤，或者离心去除。
样品纯化过程中 曲线不稳	样品或buffer中有气泡	去除样品或柱子中的气泡
		样品和buffer进行脱气
洗脱组分中没有目的蛋白	样品中抗体浓度太低	使用其抗原做配体的介质
	抗体被降解	适当的提高洗脱pH
回收率逐渐减低	上样量太多	减少上样量
	柱子太脏，载量降低	按照填料清洗部分进行树脂清洗

温馨提示：不可用于临床治疗。