比色法生物素定量试剂盒

Amplite 比色法生物素定量试剂盒

 

货号	5522	存储条件	f/l
规格	200 Tests
Ex (nm)	500	Em (nm)
分子量		溶剂

 

适用范围

用于生物素-蛋白偶联物中生物素与蛋白质的摩尔比，也用于溶液中生物素浓度的定量分析

 

产品介绍

亲和素/链霉亲和素与生物素的相互作用是已知最强的蛋白质-配体非共价生物结合（解离常数Kd=10⁻¹⁵ M⁻¹），每个亲和素分子可特异性结合四个生物素分子。这种结合具有三个显著特征：1）结合过程极其迅速；2）一旦形成复合物，其结构稳定性极高，不受pH值、有机溶剂及其他变性剂的影响；3）这种结合具有本质不可逆性，只有通过破坏蛋白质亚基结构才能释放已结合的生物素分子。

这种独特而强大的相互作用，生物素及其衍生物与各种亲和素的紧密结合特性已被广泛应用于多种生物学领域。Amplite®比色法生物素定量检测试剂盒正是利用这一原理，开发出了便捷的生物素定量解决方案。该试剂盒可精确测定生物素-蛋白偶联物中生物素与蛋白质的摩尔比，也可用于溶液中生物素浓度的定量分析。

Amplite®比色法生物素定量检测试剂盒采用HABA（4'-羟基偶氮苯-2-羧酸）作为检测试剂，其与亲和素结合时会产生显著的光谱变化。当生物素存在时，会竞争性取代HABA-亲和素复合物中的HABA，导致500nm波长处的吸光度下降，通过检测这一变化即可实现生物素的精确定量。本试剂盒的最合适的检测范围为2-16μM，支持比色皿和微孔板两种检测模式，为研究人员提供了灵活的实验选择。

注：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品说明书

样品实验方案

简要概述

1.准备HABA /抗生物素蛋白测定溶液（180μL）
2.添加测试样品（20μL）
3.在室温下孵育5分钟
4.监测500nm处的吸光度降低

 

溶液配制

1.储备溶液配制

所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。 避免反复冻融循环。
Avidin原液（100X）：
向Avidin（组分A）中加入400μLDdH2O，并充分混合。 注意：未使用的100X Avidin原液应分成一次性使用的等分试样并储存在-20℃。

 

 

2.工作溶液配制

HABA /抗生物素蛋白测定溶液：
将200μL抗生物素蛋白原液（100X）加入20 mL HABA分析缓冲液（组分B）中，并充分混合。 注意：HABA /抗生物素蛋白测定混合物的未使用部分可能在4°C储存至一周。

 

操作步骤

使用96孔微孔板定量生物素

表1.含有生物素的测试样品的布局，白色/透明底96孔微孔板中的阴性或阳性对照。 NC =阴性对照，PC =阳性对照，TS =测试样品

NC	NC	TS	TS
PC	PC	...	...
TS	TS	...	...

 

表2.每个孔的试剂组成

阳性	阴性	样品
组分C：20ul	ddH2O:20ul	20ul

 

注意：有必要在几种稀释度下测试含生物素的样品，以确保生物素浓度在测定线性范围内，2-16μM的生物素（最终浓度）。注意：避免含有钾的缓冲液，因为它会在测定中引起沉淀。注意：必须通过凝胶过滤或透析将游离生物素与生物素化蛋白分离。

1.加入20μL含生物素的样品，阴性对照（ddH2O或用于溶解含生物素的样品的相同缓冲液）和阳性对照（组分C）到96孔白色/透明底微孔板中，如表1和2。

2.将180μLHABA/抗生物素蛋白测定溶液加入含有生物素的样品，阴性对照和阳性对照的每个孔中，使总生物素测定体积为200μL/孔。注意：对于比色皿格式，添加100μL样品和900μLHABA/抗生物素蛋白测定混合物。

3.将反应混合物在室温下孵育5分钟，在摇床上以100-200rpm摇动，避光，避免在移液过程中产生气泡。

4.用吸光度读板仪在500nm处监测吸光度降低。