Path-ID qPCR MM (100 rxn.)

qPCR常见问题及其分析

一般来讲，进行real-time qPCR MasterMix都是2×的浓缩液，只需要加入模板和引物就可以。由于real-time qPCR灵敏度高，所以每个样品至少要做3个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于Ct相差较多或者SD太大，无法进行统计分析。通常来讲，反应体系的引物终浓度为100-400mM；模板如果是总RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情况下是1ul或者1ul的10倍稀释液，要根据目的基因的表达丰度进行调整。当然这些都是经验值，在操作过程中，还需要根据所用

qPCR 实验中遇到这 3 个问题怎么办？

值偏大呢？首先需要计算引物的扩增效率。 可将基因的扩增产物进行梯度稀释（至少三个梯度，且梯度之间的 △CT 均一，防止因为操作原因导致标准曲线线性关系差，进而影响扩增效率的计算），同时进行 qPCR。将得到的标准曲线进行引物扩增效率的计算： 以 Vazyme #Q711 的荧光定量 Mix 扩增某基因为例： ① qPCR 扩增： 将 qPCR 产物进行原液、1 / 10、1 / 100 梯度稀释，每个梯度设置三个复孔，进行 qPCR 扩增，复孔间 CT 值取平均值，得到三组 CT 值。 ②

qPCR 曲线有问题？带你解决这个难题

做一个特异性验证。另外，每次试验的 NTC（no template control）是一定要做哒！ （3）只有引物二聚体，无目的条带 如果扩增片段过短（小于 80bp），那么仅通过融解曲线就很难区分引物二聚/目的条带。 另外，也有可能是 qPCR 扩增效率低或者没有扩增，体系里边只有引物纠缠成的二聚体了。 总之，产物长度建议大家还是设置在 100 - 200 bp，不要太短了。