鼻气管鸟疫杆菌（ORT）核酸检测试剂盒(荧光PCR法)

鼻气管鸟疫杆菌（ORT）核酸检测试剂盒(荧光PCR法)

产品概述
产品名称：鼻气管鸟疫杆菌（ORT）核酸检测试剂盒（荧光 PCR 法）
英文名称：Ornithobacterium rhinotracheale (ORT) Nucleic Acid Detection Kit (Real-time PCR)
用途：用于禽类（鸡、火鸡等）鼻气管鸟疫杆菌的定性 / 定量检测，适用于科研或养殖企业病原筛查，不可用于人类临床诊断。
技术原理：采用TaqMan 探针法荧光 PCR，针对 ORT 保守基因（如 16S rRNA）设计特异性引物与 FAM 标记探针，扩增时探针水解释放荧光，实时监测信号并通过 Ct 值判定结果。

规格与组分
组分    规格    描述
2×PCR 反应液    1mL    含 Taq 酶、dNTP、缓冲液、Mg²⁺、UNG 酶
ORT 引物探针混合液    500μL    特异性引物 + FAM 探针
阳性对照    100μL    灭活 ORT 质粒 DNA（1×10⁸拷贝 /μL）
阴性对照    100μL    无酶纯水
说明书    1 份    操作指南

保存与稳定性
保存条件：-20℃避光，避免反复冻融；分装后可4℃短期保存（≤7 天）。
有效期：12 个月（未开封）；开封后6 个月内用完。
运输：干冰或冰袋低温运输。

样本类型与处理
适用样本：禽类气管 / 鼻窦拭子、肺、气管组织、鼻腔分泌物等。
样本处理：
拭子：洗脱至 PBS，离心取上清提取 DNA。
组织：研磨后取上清提取 DNA。
核酸提取：使用商业化 DNA 提取试剂盒，最终洗脱体积 50μL。

操作步骤
试剂准备：冰上融化试剂，瞬时离心；按 **n = 样本数 + 2（阴 / 阳性对照）+1（预留）** 配制反应液。
反应体系配制：
2×PCR 反应液：12.5μL
引物探针混合液：2.5μL
模板 DNA：5μL
无酶水：5μL
总体积：25μL
扩增程序：
预变性：95℃，10min（1 循环）。
变性：95℃，15s；退火 / 延伸：60℃，1min（42 循环）。
荧光采集：60℃时收集FAM 通道荧光。
结果判定：
阳性：FAM 通道有典型扩增曲线，Ct≤38。
阴性：无扩增曲线或Ct>38。
无效：阴性对照出现扩增或阳性对照Ct>38，实验需重做。

性能指标
灵敏度：最低检出限 **≤100 拷贝 /μL**。
特异性：与禽巴氏杆菌、大肠杆菌、支原体等无交叉反应。
重复性：批内 / 批间CV≤2%。
线性范围：10²–10⁷拷贝 /μL，R²≥0.99。

注意事项
分区操作：试剂准备、样本处理、PCR 扩增严格分区，防止交叉污染。
防污染：使用带滤芯枪头，操作时避免气溶胶；阳性对照最后加样。
仪器适配：荧光 PCR 仪（如 ABI 7500、Bio-Rad CFX96）。
废物处理：实验废弃物按 ** 生物安全二级（BSL-2）** 处理。

常见问题与解决
无扩增曲线：检查引物探针活性、模板浓度、扩增程序；确认FAM 通道设置正确。
非特异性扩增：优化退火温度、降低模板量、检查样本污染。
Ct 值偏高：提高模板浓度、延长退火时间、优化反应体系。