为什么交联会影响FFPE蛋白质组学？如何减轻其影响？

在组织样本保存中，福尔马林固定-石蜡包埋（FFPE）是一种广泛应用的标准方法，尤其在临床病理领域。然而，FFPE处理带来的蛋白质交联（crosslinking）现象，给后续的蛋白质组学分析带来了显著挑战。

 

一、什么是FFPE中的蛋白质交联？

FFPE样本的核心处理步骤包括：

1、使用10%中性缓冲福尔马林对组织进行固定。

2、将组织脱水后包埋进石蜡中以实现长期保存。

在福尔马林固定过程中，甲醛与蛋白质的氨基酸残基（特别是赖氨酸、半胱氨酸、精氨酸等）发生共价交联，形成亚甲基桥结构。这种交联结构稳定但非天然，会严重影响后续蛋白质组学研究所依赖的酶切、提取和鉴定过程。

 

二、FFPE交联如何影响蛋白质组学分析？

1、蛋白质提取效率降低

交联后的蛋白质结构更紧密、不易溶解。标准裂解液难以高效破碎这些复合物，导致蛋白提取率明显下降。

 

2、酶切效率受阻

蛋白质酶切依赖蛋白质的开放结构。交联后，酶切位点被遮蔽或结构阻碍，使得胰蛋白酶（trypsin）等蛋白酶活性大幅下降，产生的多肽片段不完全、不规律，降低肽段可识别率。

 

3、质谱识别难度增加

交联会引入非天然修饰和质量偏移，肽段质量与数据库中的理论值不符，从而增加搜索空间和识别错误率，影响定量和鉴定的准确性。

 

4、可变修饰和伪肽段增多

甲醛交联引入的新结构可能被错误识别为天然修饰，影响生物信息学分析的特异性。

 

三、如何减轻交联对FFPE蛋白质组学的影响？

尽管交联带来挑战，但通过方法学优化，可以显著改善FFPE样本的蛋白质组数据质量。以下为几种主流且实用的策略：

1、优化样本预处理

（1）去石蜡（Deparaffinization）

采用二甲苯（xylene）+梯度乙醇充分去除石蜡，避免影响后续裂解步骤。

（2）高效裂解系统

使用含SDS、TEAB、或8M尿素的裂解液，在高温高压（如加热至95°C）或微波辅助条件下，提高交联蛋白的溶解效率。

 

2、增强去交联效率（De-crosslinking）

（1）热诱导逆交联

在高温条件下（如90~100°C，数小时）进行热解处理，打断亚甲基桥，恢复部分天然结构。

（2）酸/碱辅助去交联

在酸性条件（pH~3）或碱性环境（如Tris-HCl，pH 9.0）下配合加热，有助于断裂交联键。

（3）添加辅助试剂

部分研究采用去交联缓冲液（如Antigen Retrieval Buffer）或DEPC辅助裂解增强蛋白释放。

 

3、酶切策略调整

（1）延长酶解时间

为了克服酶切位点遮蔽，可延长酶解时间至16-24小时，甚至双酶（Trypsin + LysC）联合使用。

（2）FASP或SP3等方法结合

使用滤膜辅助样本制备（FASP）或磁珠纯化方法（SP3）可提高酶解效率并减少样本损失。

 

4、质谱和数据库优化

（1）使用专用数据库

引入考虑交联修饰的数据库（如将甲醛相关修饰作为可变修饰项），提升肽段匹配效率。

（2）调整搜索参数

在MaxQuant、PEAKS、MSFragger等分析软件中，开启非特异酶切（semi-specific）模式、设定甲醛相关修饰，有助于发现“非标准”肽段。

 

四、百泰派克生物科技的解决方案：提升FFPE蛋白质组数据质量

在百泰派克生物科技，我们针对FFPE样本的复杂性，开发了一整套优化质谱蛋白组学流程，包括：

 

• 专属去交联裂解缓冲系统。
• 热诱导与酶法联合处理策略。
• 高灵敏度质谱平台（如Orbitrap Fusion Lumos、Exploris 480）。
• AI辅助的数据库搜索算法，提升低丰度蛋白识别率。

 

借助这些定制化手段，我们可在FFPE样本中实现>6000个蛋白质的高覆盖度鉴定，并保持良好的重复性（CV < 15%），广泛应用于癌症标志物发现、病理组织机制研究等领域。

 

尽管FFPE处理引入蛋白交联影响质谱分析，但随着方法的不断优化，其在临床样本利用和转化医学研究中的价值正在被逐步释放。对于需要挖掘FFPE样本蛋白组信息的研究者而言，选择具备经验的服务平台，如百泰派克生物科技，将有助于提升实验效率与数据可用性。

 

 

 

 

百泰派克生物科技特色项目

 

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

 

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

 

 

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

 

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

 

 

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

 

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

 

 

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

 

 

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

 

 

百泰派克生物科技七大检测平台

 

 

 

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等专业服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，专业提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

2.获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；

3.业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；

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