小鼠B细胞分选试剂盒(阴选)

产品简介
小鼠 B 细胞分选试剂盒通过阴性分选法从小鼠脾脏、淋巴结或骨髓细胞中分离B细胞。原理是选用不同的生物素（Biotin）标记单克隆抗体对非目标细胞（非B细胞）进行标记，然后通过链霉亲和素（Streptavidin）标记的磁珠对非目标细胞进行清除，从而达到分选小鼠B细胞的目的。分选过程需要用到磁力架。

储存条件及有效期
2-8°C 保存，不可冷冻，有效期见试管标签。

适用范围
本试剂盒适用于分选小鼠脾脏、淋巴结和骨髓中的B细胞。

操作流程
1. 制备单细胞悬液：在70μm细胞筛网上研磨脾脏，以预冷的PBS冲洗细胞筛网，收集细胞悬液于50mL离心管中。骨髓细胞悬液制备后同样使用70μm细胞筛网过滤，收取细胞悬液至50mL离心管中。500g，离心5min。
2. 离心结束，弃上清，按照每只小鼠加入5mL红细胞裂解液（ACK），室温裂解5min，再加入20mL PBS终止裂解，500g，离心5min。
注意：红细胞裂解步骤可根据组织样本及所用裂解液的不同调整用量及时间。少量红细胞残留不会影响分选细胞纯度。
3. 离心完成后，弃上清，将脾细胞或骨髓细胞重悬于PBS。细胞悬液用70μm细胞筛网过滤后，500g，离心5min。
注意：细胞悬液需要过细胞筛网，以除去组织和细胞团块，否则会影响后续细胞分选纯度。
4. 离心完成后，将细胞重悬于分选buffer中，调整细胞密度为 1×10⁸cells/mL。
注意：分选 buffer 为含有 2mM EDTA 和 2% 胎牛血清（FBS）的 PBS 或者含有 2mM EDTA 和 0.5% BSA的 PBS，需预先通过 0.22μm 滤膜过滤除菌。
5. 将100μL细胞悬液（1×10⁷个细胞）加入1.5mL离心管底部，再加入2μL Biotin-Antibody Mix，混匀后4℃孵育10min。孵育完成后，加入1mL分选buffer，500g离心5min。弃上清，向细胞沉淀加入100μL分选 buffer，重悬细胞，转移至无菌流式管。
注意：加入细胞悬液时将细胞加入离心管或流式管底部，避免沿管壁加入。根据所使用磁力架不同也可全程使用离心管进行细胞分选。如果分选更多细胞，则按比例增加 Biotin-Antibody Mix 的用量。
6. 向流式管中加入20μL清洗过的Streptavidin（磁珠使用前需要用分选buffer进行清洗：涡旋振荡彻底重悬磁珠，吸取实验需要的磁珠至1.5mL离心管，加入1mL分选buffer，10000g离心1min，或使用磁力架磁吸3min，弃上清。加入1mL分选buffer重复洗涤磁珠 1 次后用与原来相同体积的分选buffer重悬磁珠。如吸取20μL磁珠进行清洗，则清洗后用20μL分选buffer进行重悬），混匀后 4℃ 静置孵育10min。
注意：如果分选更多细胞，则按比例增加Streptavidin 用量。例如分选5×10⁷个细胞，在500μL细胞悬液中加入10μL Biotin-Antibody Mix 和100μL Streptavidin。如果分选少于1×10⁷个细胞，则将细胞悬液体积补至100μL，加入2μL Biotin-Antibody Mix 和 20μL Streptavidin。
7. 孵育完成后，在流式管中加入2.5mL分选buffer，用移液器上下混合吹打 5 次混匀（避免剧烈振荡或者上下颠倒混匀）。
8. 将含有细胞的分选流式管置于磁力架上，静置5min。
9. 将细胞悬液轻柔倒入一个无菌离心管中（倾倒过程中流式管不要脱离磁力架），此细胞悬液中即包含纯化的小鼠B细胞，500g，离心5min。离心后弃上清，收集细胞。
10. 根据实验需要洗涤细胞后，将细胞重悬于所需缓冲液或培养基中，即可用于后续分子生物学或细胞生物学实验。

分选效果
从 C57BL/6 小鼠骨髓细胞和脾脏细胞中分选B细胞，分选前后的细胞用 FITC 标记的anti- mouse CD3抗体（克隆号145-2C11）和APC标记的anti-mouse CD19抗体（克隆号6D5）染色后进行流式细胞分析。骨髓细胞分选前后B细胞纯度分别为24.6%和95.8%，脾细胞分选前后B细胞纯度分别为62.9%和97.8%。

注意事项
1. 磁珠使用和保存过程中应避免冷冻；
2. 建议选用低吸附移液器吸头和离心管，避免因吸附造成磁珠的损耗；
3. 取用磁珠前选择合适量程的移液枪，以吹打的方式彻底重悬磁珠，注意吹打时避免产生气泡；
4. 本产品仅供科研使用。