ATCC 6633 枯草芽孢杆菌标准菌株

       ATCC 6633枯草芽孢杆 菌（Bacillus spizizenii ATCC 6633，原分类为Bacillus subtilis ATCC 6633） 是制药微生物质量控制中重要的标准芽孢杆菌参考菌株之一。它被USP和FDA法规明确指定用于非无菌药品微生物计数测试、无菌检查的培养基生长促进测试，直接保障培养基性能的可靠性和无菌工艺验证的有效性。该菌株严格遵循“种子批系统”（seed-lot system）管理，传代次数不得超过5次，以维持遗传稳定性和测试结果的可追溯性。

一、在USP法规中的主要用处及法规引用

1. USP <61> Microbiological Examination of Nonsterile Products: Microbial Enumeration Tests（非无菌产品微生物计数测试） 该菌株是生长促进测试（Growth Promotion Test）和方法适用性测试（Suitability of the Counting Method）的指定细菌对照，用于验证Soybean-Casein Digest Agar/Broth（TSA/TSB）等培养基对细菌的回收能力。接种量≤100 CFU，30~35℃孵育18~24小时，要求菌落恢复率符合药典标准（通常≥50%~70%，且不得超过计算值的2倍）。这确保了药品总好氧微生物计数（TAMC）的准确性。
2. USP <71> Sterility Tests（无菌检查） 该菌株是生长促进测试（Growth Promotion Test）的核心需氧细菌对照，用于Soybean-Casein Digest Medium（SCDM）的性能验证。接种≤100 CFU，30~35℃孵育不超过3天，必须观察到明显可见生长。这直接验证无菌检查培养基对需氧芽孢杆菌的支持能力，是无菌产品放行测试的必备环节。
3. 其他相关USP章节：
   • USP <2021> Microbial Enumeration Tests（膳食补充剂微生物计数测试）。
   • USP <81> Antibiotics—Microbial Assays（抗生素微生物测定）。
   • USP <72> Respiration-Based Microbiological Methods（呼吸代谢法微生物污染检测）。
   • USP <56> Methods for Determination of Resistance of Microorganisms to Sterilization Processes（微生物对灭菌工艺耐受性测定方法）。 来源：U.S. Pharmacopeia General Chapters <61>、<71>、<2021>、<81>等（当前USP-NF版）。

二、在FDA法规中的用处及法规引用

FDA通过Pharmaceutical Microbiology Manual（ORA.007, Revision 02, 2020） 完全采纳USP方法，并明确将ATCC 6633指定为非无菌产品微生物检查（<61>）的标准测试菌株：

• Chapter 2（Microbial Examination of Non-Sterile Products）：用于生长促进测试和方法适用性验证，悬液可在2~8℃保存至验证期（芽孢悬液最长7天）。 FDA在cGMP现场检查、ANDA/NDA申报中，要求必须使用药典指定菌株，否则方法视为不适合。

官方引用来源（建议查阅新版）：

• USP-NF 当前版：<61>、<71>、<2021>、<81>（USP官网）。
• FDA Pharmaceutical Microbiology Manual（）。
• ATCC官网产品页（），明确标注USP <61>、<71>、<2021>、<72>、<81>推荐菌株。

注意：ATCC近期已将该菌株分类更新为Bacillus spizizenii，但USP/FDA仍继续引用ATCC 6633菌株号，实验室操作以菌株号为准。

三、操作培养的难点（制药QC实验室实际经验总结）

ATCC 6633虽为BSL-1级菌株，但在日常QC操作中作为芽孢杆菌存在一定技术挑战，我实验室已建立严格SOP并持续再验证，难点如下：

1. 产孢稳定性与悬液制备：作为芽孢杆菌，需确保良好产孢才能获得稳定的孢子悬液。培养条件稍有偏差（温度、湿度或培养基）易导致菌丝/营养体过多而非孢子，影响CFU一致性。FDA允许芽孢悬液2~8℃保存7天，但制备时仍需涡旋充分分散并立即验证浓度。
2. 孵育条件精确控制：Soybean-Casein Digest Agar/Broth（pH 7.3±0.2），必须精确控制30~35℃（±2.5℃）有氧孵育18~24小时（<71>不超过3天）。温度微小偏差易导致生长过慢或假阴性，影响生长促进测试通过率。与真菌（20~25℃）需独立温箱管理。
3. 种子批管理和传代限制：必须采用种子批系统，主种子批-80℃或液氮冻存，工作种子批≤5次传代。冻干安瓿复苏后需严格按ATCC协议制备悬液，否则活力下降会导致方法适用性测试失败。
4. 方法适用性验证复杂：产品中和剂/稀释剂必须验证对该菌株的回收率（≥50%），含抗菌成分的产品易导致假阴性；同时需确认芽孢悬液在SCDM中的生长特性与药典要求一致。
5. 形态观察与计数一致性：菌落可能呈现典型枯草芽孢杆菌形态，但老培养物易出现变异，平板计数时需统一选择典型菌落，避免误判。