双萤光素酶报告基因检测(启动子活性检测)

双萤光素酶报告基因检测（启动子活性）实验

摘要：通过双萤光素酶报告基因系统检测转录因子steroidogenic factor-1（SF-1）能否与Oct-4启动子片段发生作用。实验结果显示二者存在调控关系。
关键词：steroidogenic factor-1（SF-1），Oct-4 promoter，transcription factors，Dual-Reporter Assay，

一、 实验原理
萤光素酶是理想的报告基因，因为哺乳动物细胞中不含内源性萤光素酶，一旦转录完成立刻就生成功能性的萤光素酶。单报告基因实验往往会受到各种实验条件的影响，而双报告基因则通过共转染的“对照”作为内参为试验提供一基准线，从而可以在最大程度上减小细胞活性和转染效率等外在因素对实验的影响，使得数据结果更为可信。Dual-Luciferase®双萤光素酶报告基因检测系统在细胞中同时表达萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶，两者没有种源同源性并对应不同的反应底物，故而没有交叉干扰。得益于超强的光信号和超高的信噪比，本系统被广泛用于miRNA靶基因验证。
转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异序列结合，这些特异性的序列被称为顺式因子，转录因子的DNA结合域和顺式因子实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。萤光素酶报告基因实验（luciferase Assay）是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段，其原理简述如下：（1）用靶启动子的特定片段替换报告基因质粒（如pGL3-basic）的启动子区。（2） 将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转。如果该转录因子能够激活靶启动子，则萤光素酶就会表达，且其表达量与转录因子的作用强度成正比。（3） 加入特定的底物，萤光素酶与底物反应，产生萤光素，检测荧光的强度可以对萤光素酶的活性定量，进而判断该转录因子能否与靶启动子片段发生作用 （及其作用强度）。

二、 实验目的
验证转录因子SF-1能否与Oct-4启动子片段发生作用。

三、 实验步骤

1. 质粒转染细胞：
1) 细胞铺板：将细胞按70%的汇合度接种到96孔板。
2) 转染：16h后转染萤光素酶报告基因质粒和RNA，每个样品设置6个复孔
a) 配制DNA和转染试剂: 96孔板转染质粒时每孔比例为pLenti：Firefly：Renilla：转染试剂=0.2μg：0.1μg：0.01μg：0.25μL
b) 稀释好DNA及转染试剂，常温孵育5min
c) 将稀释好的DNA分别和转染试剂混匀，常温孵育20min
d) 每孔弃去15μL培养基，将15μL DNA转染混合液添加到每孔细胞样品中
e) 转染6h后，换新鲜完全培养基

2. 双报告基因检测
a) 质粒共转染48h后，弃去培养基，用100μL 1XPBS洗1遍
b) 倾斜96孔板，吸干剩余的PBS
c) 去离子水将5XPLB稀释成1XPLB，使用前放到常温
d) 每孔加50μL稀释好的 1X PLB，摇床常温条件下摇15min，进行裂解
e) 白色不透光的96孔酶标板中每孔加步骤4的上清液10μL， 加入100μL预先混好的LAR II，2s后测数据
f) 每孔添加100μL预先混好的Stop&Glo Reagent，静止2s后，测数据
注意：进行Luciferase活性检测时，需在避光条件下进行。

四、 实验结果

空白校准后的数据：

Firefly luciferase的数据除以Renialla luciferase的数据，用平均值做图。
p值的计算方法为双侧student-T-test。P值判断两组数据的差异是否显著。

图1.SF-1调控Oct-4启动子区
***表示p<0.001

结论：从图1的结果可以看到，在SF-1过表达的情况下，Oct-4启动子活性相对对照组明显升高（p<0.001）。

五、 参考文献
1. Yang HM, Do HJ, Kim DK, Park JK, Chang WK, Chung HM, Choi SY, Kim JH.Transcriptional regulation of human Oct-4 by steroidogenic factor-1.J Cell Biochem. 2007;101(5):1198-1209.
2. Lorenz WW, McCann RO, Longiaru M, Cormier MJ.Isolation and expression of a cDNA encoding Renilla reniformis luciferase.Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 May 15;88(10):4438-42.
3. Farr A, Roman A. pitfall of using a second plasmid to determine transfection efficiency.Nucleic Acids Res. 1992 Feb 25;20(4):920.
4. 3. Sherf, B.A. et al. Dual-Luciferase® reporter assay: An advanced co-reporter technology integrating firefly and Renilla luciferase assays. 1996 Promega Notes 57, 2-9.