Caspase-8 Activity Assay Kit (

产品描述

Caspases（Cysteine-requiringAspartate Proteases）是一个高度保守的半胱氨酸蛋白酶家族，特异性识别底物中的天冬氨酸残基，在介导细胞凋亡的过程中发挥着非常重要的作用。Caspases以潜在酶原的形式表达，通过自发蛋白分解机制或经其他蛋白酶（通常是其他caspases）加工处理的方式被活化。人caspases可细分为三大功能组：细胞因子活化（caspase-1，-4，-5和-13），凋亡启动（caspase-2，-8，-9和-10）和凋亡执行（caspase-3，-6和-7）。

Caspase-8（Caspase 8），也称为Mch5，MACH和FLICE，位于caspase级联层次结构的顶端，是“上游”成员或caspases的启动家族。以无活性酶原的形式存在细胞内，分子量55kDa。一旦募集到死亡受体胞浆结构域（比如Fas），通过配体蛋白FADD，即被激活，形成一个由18kDa和12kDa亚基组成的二聚体，进一步激活下游的caspases（-3，-6和-7），进而切割关键的细胞底物，导致细胞凋亡性死亡。

Caspase-8活性检测试剂盒（比色法）（Caspase-8 Activity Assay Kit, Colorimetric or Caspase-8 Colorimetric Assay Kit）以偶联上发色基团pNA的caspase-8序列特异性的多肽为底物。当底物被caspase-8剪切后，发色基团被释放出来，进而用酶标仪或分光光度计来测定其吸光值（λ=405nm或400nm）。通过计算OD凋亡诱导组/OD阴性对照组的比值来确定凋亡诱导组caspase-3的活化程度。

本品适用于培养细胞以及新鲜组织的caspase-8活性检测。

保存与运输方法

保存：-20℃保存，1年有效。开盒后置Lysis Buffer和2× Reaction Buffer于2-8℃保存。Caspase-8 Substrate和0.1M DTT需要避光冻存。

运输：冰袋运输。

注意事项

1） Caspase-8 Substrate需避光保存和使用。

2） 某些凋亡诱导剂诱导的凋亡可能通过caspase-8非依赖的方式进行，此种情况使用本品检测的caspase-8活性无明显变化，则，需要考虑凋亡机制中的其他信号通路。

3） 起始细胞数量需达3~5×10⁶个或新鲜组织量达50~100mg，以保证达到测定所需的100~200μg蛋白量。Caspase-8的活性与细胞裂解后的蛋白含量有关，如测定的OD值偏低，可通过增加细胞数量或组织量的方法来提高蛋白量。

4） 优先选择测定λ=405nm的吸光值；如有困难，再测定λ=400nm的吸光值。

5） 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

1.需要的其他试剂和材料

仪器：低温高速离心机、酶标仪或分光光度计（100μl的比色皿）（λ=405nm或400nm）、微量移液器、玻璃匀浆器（组织样本）

耗材：1.5ml微量离心管、96孔酶标板（透明）或100μl的比色皿

试剂：PBS、蛋白定量试剂（比如：Bradford法蛋白浓度测定试剂盒）

2.试剂准备

2.1 Lysis Buffer（含DTT）

于实验前，按每50μl Lysis Buffer 加入0.5μl DTT的比例准备足量的裂解工作液，置于4℃或冰上待用。

2.2 2×Reaction Buffer（含DTT）

于使用前，按每50μl 2×Reaction Buffer 加入0.5μl DTT的比例准备足量的反应工作液。

3.样本准备

3.1 细胞裂解

a）用合适方法诱导细胞凋亡，同时设立阴性对照组（不加诱导剂），收集3~5×10⁶个细胞。

b）PBS洗涤细胞2次（2000rpm，离心5min），尽量吸尽PBS上清。

c）往离心的沉淀细胞中加入15~200μl预冷的Lysis Buffer（含DTT），吹打混匀。

d）置冰上裂解20~60min，其间涡旋振荡3~4次，每次10s；或冻融2~3次。

e）4℃，10,000rpm离心1min。

f）小心吸取上清（含裂解释放的蛋白质）转移到新的EP管内，置于冰上待用。

g）取少量上清（1~2μl），用常规方法（Bradford法）测定蛋白浓度。

3.2 组织裂解

a）取50~100mg组织置于培养皿内，用手术剪剪碎成3mm×3mm左右的小块，加入150~200μl预冷的Lysis Buffer（含DTT），用玻璃匀浆器上下手动匀浆15次，注意低温操作。

b）将组织匀浆液转移到1.5ml预冷的离心管，10,000rpm，4℃离心5min。

c）小心吸取上清（含裂解释放的蛋白质）转移到新的EP管内，置于冰上待用。

d）取少量上清（1~2μl），用常规方法（Bradford法）测定蛋白浓度。

4.Caspase-8活性检测