Fluo-5N AM, Cell Permeant 钙离子荧

基本介绍：

Fluo-5N是Fluo-4的结构类似物，具更低的钙结合亲和力，使其非常适用于钙水平在1µM~1mM区间内的胞内钙离子检测，而Fluo-3和Fluo-4在这个区间内的钙离子反应达到饱和。Fluo-5N与氩离子激光器的488nm激发光兼容，使其适用于共聚焦显微镜、流式细胞仪、荧光酶标仪等仪器。激发和发射波长分别是494和516nm。一旦与钙离子结合，荧光强度增加大于100倍，波长迁移非常少。

Fluo-5NAM是Fluo-5N的一种乙酰甲酯衍生物，具有细胞膜渗透性，只需简单培养，即可轻易进入细胞。

产品特性

1）同义名：Fluo-5N, Acetoxymethyl Ester;

2）分子式：C50H47F2N3O25

3）分子量：1127.92

4）Ex/Em：494/516nm（Ca2+-bound）

5）解离常数：~90µM

6）纯度：≥95% (HPLC)

7）溶解性：溶于DMSO（5mM）

保存与运输方法

保存：-20℃干燥避光保存，有效期至少1年。

运输：冰袋运输。

注意事项

1）  荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

2）  乙酰氧基甲基酯（AM）易吸潮，冰箱取出后请在干燥的环境放至室温后再开封。由于试剂微量，开封前请将其短暂离心，以保证粉末落入管底。

3）  Fluo-5NAM在4℃、冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内，可在20-25℃温育片刻至全部融解后使用。

4）  Fluo-5NAM第一次使用，建议储存液现配现用，分装成单次用量，严格做到≤-20℃密封干燥冻存，以防止受潮。为了保证良好的实验效果，尽量在短时间内使用。

5）  为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

A，  试剂准备

1）  配制Pluronic F-127母液：称取100mgPluronic F-127粉末中加入500μl DMSO，配制成20%(w/v) DMSO母液。溶解过程需要在40-50℃加热20-30min。溶液室温保存，不用冷藏。如有结晶析出，可以重新加热后溶解，不影响使用。

2）  HHBS Buffer(1X Hank’s Balanced Salt Solution with 20mM HEPES buffer, pH 7.2)或者其他生理缓冲液

B，操作步骤

1）  用无水DMSO溶解Fluo-5NAM配制成2-5mM的储存液，或将已配好的Fluo-5NAM储存液取出于室温回温。（如：若配制成4mM的母液，需向50µg Fluo-5NAM中加入11µl无水DMSO）。准备Fluo-5NAM工作液之前，有时需要往Fluo-5NAM储存液中加入适量的20% Pluronic F-127溶液，以增强AM探针的水溶性。

【注①】：Fluo-5N AM染色工作液制备前，添加一定体积的20% Pluronic F-127溶液到Fluo-5NAM+ DMSO储存液，从而使Pluronic F-127的最终工作浓度约为0.02%。

2）  用HHBS或其他生理缓冲液（含钙镁）将Fluo-5NAM+DMSO储存液稀释到1-20µM的工作液。

【注①】：Fluo-5N AM应用在大部分细胞的推荐加载浓度为4-5µM，具体的使用浓度需根据实验要求进行优化。为了避免过度加载造成细胞毒性，建议在取得有效结果的基础上尽量使用最低探针浓度。

3）  【可选】如果细胞内（比如CHO细胞）含有机阴离子转运体，丙磺舒（Probenecid，1-2.5mM）或磺吡酮（Sulfinpyrazone，0.1-0.25mM）可能需要加入细胞培养基内，以降低去酯化探针的泄露水平。

4）  将准备好的Fluo-5NAM染色工作液加入细胞，加入量以覆盖细胞为准。室温或37℃孵育20-120min。

【注①】：若使用含血清的培养基，血清内酯酶会降解AM，从而降低Fluo-5NAM加载效果。而含酚红培养基会使本底值略偏高，建议加入染色工作液前，对细胞清洗2~3次。

5）  吸掉染色工作液，并用HHBS或其他生理缓冲液（如有必要，使用含转运体抑制剂如1mM丙磺舒的缓冲液）清洗细胞1~2次，以去除残留探针。

6）  室温再孵育30min以保证细胞内AM的完全去酯化。

7）  用合适的激发/发射波长来检测荧光（见附录I：Fluo-5N的激发和发射光谱）