Calcein AM/PI Double Stain Kit

产品描述

Calcein, AM，中文名钙黄绿素乙酰甲酯，CAS NO：148504-34-1，一种具细胞膜渗透性的活细胞荧光染料，呈绿色荧光（Ex/Em= 490nm/515nm）。AM基团的存在不仅加强疏水性，使其能轻易穿透活细胞膜。而且封闭结合钙离子的分子部分，本身不发荧光。一旦进入细胞后，被细胞内酯酶水解为钙黄绿素（calcein），能与胞内钙离子结合，产生强烈的绿色荧光。因不具有细胞膜渗透性，从而被保留在胞内。与其它活细胞染料（如BCECF-AM，CFDA）相比，Calcein, AM最适合用于活细胞染色探针，因细胞毒性很低，而且不会抑制任何细胞功能如增殖或淋巴细胞趋化性。另外，使用Calcein, AM活性检测的实验结果十分可信，与标准的51Cr释放法所得结果一致。

由于死细胞缺乏酯酶，Calcein, AM仅对活细胞进行标记，这一特征使其非常适合用来检测细胞活力和细胞的短期示踪。常常与碘化丙啶PI联合使用，因其仅能穿过死细胞膜的无序区域到达细胞核，嵌入细胞的DNA双螺旋区域，并产生红色荧光（Ex/Em= 535nm/617nm），仅对死细胞染色。由于Calcein和PI-DNA都可被490 nm激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。用545 nm激发，仅可观察到死细胞。结合这些特点，Calcein, AM和PI经常被结合用作活细胞和死细胞的双重染色。

本试剂盒就是结合Calcein-AM和PI的双重染料，来进行活细胞和死细胞的双重染色标记，从而进行活细胞和死细胞水平的分析。根据试剂盒优化体系，单次以200µl细胞悬液进行染色，分别可做500次和1000次检测。

保存与运输方法

保存：-20℃避光保存，有效期一年。

运输：冰袋运输。

注意事项

1）由于Calcein-AM对湿度非常敏感，若是Calcein-AM溶液每次取完需要量后，必须紧紧密封盖子。建议根据单次用量，分装密封保存。Calcein-AM工作液必须现配现用。

2）碘化丙啶（PI）有一定的致癌性，操作时一定要注意防护。若接触到皮肤，需要立即用自来水清洗。

3）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

一、试剂准备

1.1 1×反应缓冲液（Assay Buffer）的配制

从低温冰箱内取出10×Assay Buffer，根据单次用量无菌条件取出适量，用去离子水（dH2O）做10倍稀释以得到1×Assay Buffer。

1.2   1×染色工作液（Stain Buffer）的配制

1）   先将低温保存的Calcein AM溶液 (4 mM)和PI溶液（1.5 mM）室温回温至少20min，使其充分融化。【注意：第一次使用时建议对储存液根据单次用量分装，特别是Calcein AM，以减少反复冻融次数。】

2）   取5µl Calcein AM溶液 (4 mM)和15µl PI溶液（1.5 mM）加入5ml 1×Assay Buffer，充分混匀。此时得到Calcein AM的工作液浓度为4μM，PI的工作液浓度为4.5μM。由于不同细胞系的最佳染色条件不同，初次实验建议做梯度实验，以确定 Calcein-AM和PI的最适浓度。梯度筛选的原则为使用最低的探针浓度得到较好的荧光结果。【注意：染色工作液必须现配现用，并且在当天用完。】

二、染色步骤

2.1  对于贴壁细胞，先用细胞刮刀或者胰酶-EDTA消化细胞，之后离心收集细胞（1000 rpm，3min）。

对于悬浮细胞，直接离心（1000 rpm，3min）收集细胞。

2.2  去上清，用1×Assay Buffer充分清洗细胞2~3次，以充分去除残留的酯酶活性。

2.3  用1×Assay Buffer制备细胞悬液，使其密度为1×105~1×106细胞/ml。

2.4  取100µl染色工作液加入200µl细胞悬液内，混匀，37℃孵育15min。

【注意：如果需要，可延长孵育时间至30min。】

2.5  荧光显微镜下使用490±10 nm激发滤片同时检测活细胞（黄绿色荧光）以及死细胞（红色荧光）。另外，使用545nm的发射滤片仅能观察到死细胞。也可以直接在荧光酶标仪下使用合适的滤片进行检测。

【注意】：可以使用以下方法来优化得到两种荧光染料的最佳工作浓度。

1. a)  用0.1%皂素或者0.1-0.5%地高新孵育细胞10min，或者用70%乙醇孵育细胞30min，从而制备死细胞；
2. b)  用0.1-10µM的PI溶液进行死细胞染色，以得到仅仅对细胞核染色，而不会对细胞质染色的最佳工作浓度。
3. c)  用0.1-10µM的Calcein AM进行死细胞染色，以得到不会对细胞质染色的最佳工作浓度。然后用此浓度进行活细胞染色，去观察是否活细胞能被染色。