OPD

ELISA 实验操作要点

(1) 显色 显色是 ELISA 中的最后一步温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。在定量测定中，加入底物后的反应温度和时间应按规定力求准确。定性测定的显色可在室温进行，时间一般不需要严格控制，有时可根据阳性对照孔和阴性对照孔的显色情况适当缩短或延长反应时间，及时判断。 OPD 底物显色一般在室外温或 37℃ 反应 20-30 分钟后即不再加深，再延长反应时间，可使

【视频】ELISA 实验操作，你知道多少呢？

℃ 作用 1～2 小时。4. 洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含 0.05% 吐温-20）洗 3 次，每次 5 分钟。5. 加入 0.2 ml 用稀释缓冲液稀释的酶标记特异性抗体溶液，37℃ 作用 1～2 小时或由预试实验确定作用时间。6. 洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含 0.05% 吐温-20）洗 3 次，每次 5 分钟。7. 加入 0.2 ml 底物溶液于每个凹孔（OPD 或 OT），室温作用 30 分钟（另作一空白对照，0.4 ml 底物加 0.1 ml 终止

ELISA中的试剂－酶的底物

3.3 　酶的底物 3.3.1 　HRP的底物 HRP催化过氧化物的氧化反应，最具代表性的过氧化物为H2O2，其反应式如下： DH2+ H2O2 D+ H2O 上式中，DH2为供氧体，H2O2为受氢体。在ELISA中，DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物，以便作比色测定。常用的供氢体有邻苯二胺(O-phenylenediamine, OPD)、四甲基联苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine, TMB)和ABTS[2,2'-azino