如何使用质谱准确测定蛋白质分子量？

蛋白质是细胞生命活动的核心功能分子，其分子量直接反映其氨基酸序列和结构完整性，是蛋白质鉴定、功能预测、质量控制等研究的关键参数。在生物医药领域，蛋白质分子量的细微变化常常代表着翻译后修饰（如糖基化、氧化）或降解产物的出现，对药物研发与质量放行具有重要意义。因此，建立一种高精度、高灵敏度且适用于不同类型蛋白的分子量测定技术，对于科研人员和生物制药企业都具有不可替代的价值。而质谱（Mass Spectrometry, MS），凭借其卓越的分辨率与分子识别能力，正成为测定蛋白质分子量的shǒuxuǎn技术。

 

一、质谱测定蛋白质分子量的基本原理

质谱测定蛋白质分子量的核心逻辑在于：将待测蛋白电离形成带电离子，进入质量分析器后，通过其“质荷比”（mass-to-charge ratio, m/z）来推算其真实分子质量。现代蛋白质质谱分析主要采用两种软电离技术：

 

• 电喷雾电离（Electrospray Ionization, ESI）：适用于液相样本，能将蛋白质带入多个电荷态，有助于高质量分辨
• 基质辅助激光解吸电离（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization, MALDI）：适用于干态样品，形成单电荷离子峰，便于快速鉴定

 

电离后的离子进入质谱分析器（如Orbitrap、TOF或Q-TOF）后，根据飞行时间、电场偏转或傅里叶变换等技术原理，对其m/z进行解析。对于多电荷分布的ESI谱图，需借助解卷积算法将多个信号还原为实际中性分子量。

 

二、常见平台与适用电离策略概览

在蛋白质分子量测定中，质谱平台的选择对结果精度与适用性有重大影响。以下从不同技术特点进行简要对比说明：

1、电喷雾电离（ESI）平台

常搭配Orbitrap、Q-TOF、三重四极杆质谱系统使用。其最大优势在于产生多电荷离子峰，使高分子蛋白的m/z值落入质谱仪检测范围。ESI非常适合原核或真核表达体系中的重组蛋白、融合蛋白及单克隆抗体分析，尤其在需要保留原始构象或进行非变性质谱时优势明显。

 

2、MALDI平台

通常结合TOF/TOF系统，适用于需要高通量、单电荷检测的场景。该技术在蛋白指纹图谱、快速质控检测中应用广泛，但对于复杂修饰或高分子蛋白的分辨能力相对有限。

 

三、从m/z到分子量：解读计算逻辑与技术挑战

1、计算公式简述

蛋白质通过质谱分析后，得到的是多个m/z信号，而不是直接的分子质量。常用的反推公式如下：

分子量 = (m/z × z) - z × 质量单位（通常为质子质量）

其中 z 为电荷数，通过观察不同m/z间的差值可以推断得出。对于带有多个电荷的蛋白，需要利用专业软件进行解卷积（Deconvolution），将m/z峰群还原为真实的中性分子量。

 

2、实际挑战详解

（1）翻译后修饰引起的质量偏移：例如N-端乙酰化（+42 Da）、糖基化（+162–2000+ Da不等）或氧化修饰（+16 Da）均会导致分子量偏离理论值，需结合数据库和修饰预测工具进行综合分析。

（2）缓冲液成分干扰：某些样本含有高浓度盐或去污剂（如SDS、Tris等），会严重抑制电离效率，导致信号强度下降甚至完全不可检测。因此在上机前需进行严格的脱盐纯化。

（3）高分子蛋白电离效率低：分子量超过100 kDa的蛋白在ESI模式下电离效率显著下降，需通过优化电喷雾参数、提高有机溶剂比例，甚至结合前处理策略提升信号强度。

 

四、蛋白质分子量测定的标准操作流程

为了确保质谱测定蛋白质分子量结果的准确性与可重复性，建议严格遵循以下实验流程：

1、样本制备

（1）浓度建议：0.5–2 μg/μL；

（2）缓冲体系要求：避免含有SDS、EDTA等电离抑制剂；如有盐或甘油，需经C18或Zeba脱盐处理；

（3）纯度要求：蛋白纯度越高，质谱信号越清晰，建议使用SDS-PAGE或SEC预检样本纯度。

 

2、电离方式选择

（1）对于小分子蛋白（如多肽、酶）：推荐使用ESI，可结合LC-MS直接分析；

（2）对于高分子蛋白或结构刚性的蛋白质复合物：可使用MALDI，前提是进行充分去盐和点样优化。

 

3、数据采集与分析

（1）建议使用分辨率≥60,000的高分辨质谱平台（如Orbitrap Exploris系列）以提高质量精度；

（2）对于复杂样本或蛋白混合物，可联合使用MS1（分子量测定）与MS2（肽段信息）策略；

（3）数据解卷积可使用Protein Deconvolution、MaxEnt1或BioPharma Finder等软件工具，提升分子量还原的准确性。

 

质谱测定蛋白质分子量，是连接蛋白表达、结构分析与质量控制的关键纽带。随着仪器灵敏度和数据算法的不断升级，质谱将在未来生命科学研究与药物开发中发挥更大的价值。百泰派克生物科技将持续优化质谱平台与数据解读能力，助力更多科研项目与产业应用实现从定性到定量的飞跃。

 

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百泰派克生物科技特色项目

 

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

 

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

 

 

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

 

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

 

 

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

 

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

 

 

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

 

 

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

 

 

百泰派克生物科技七大检测平台

 

 

 

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等专业服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，专业提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

2.获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；

3.业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；

4.七大质量控制检测平台，满足您一站式服务需求；

5.服务3000+企业，10000+客户的选择；

6.致力于为您提供优质的生物质谱分析服务!