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- 中国
- 2025年11月21日
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文献和实验一步法提取质粒DNA主要用于鉴定阳性克隆。 主要步骤如下： 收集1.5mL菌体，彻底除去培养基； 加入50ulSTE缓冲液重悬菌体； 加入50ul酚：氯仿;异戊醇（25：24：1），混匀； 12000rpm离心5分钟，取上清到另一离心管中； 加入NH4Ac至终浓度2M，并加入2倍体积的乙醇，混匀，室温或冰上放置几分钟； 12000rpm离心5分钟，弃上清，75%乙醇清沉淀； 沉淀干后，以水或TE缓冲液溶解，便
的浓度。 4.抽提的质粒 DNA 电泳时怎么出现切口、断裂或降解现象？ （1）使用的是收集后冷冻保藏的细菌。解决方法：使用新鲜培养的细菌。 （2）宿主菌富含核酸内切酶。解决方法：增加一步 Rinse A 洗涤步骤以彻底去除残留的核酸内切酶。或者将质粒 DNA 进行乙醇沉淀。 （3）质粒 DNA 在 Solution II 中暴露过久，易造成质粒 DNA 的切口断裂。裂解步骤控制在 5 分钟内完成。 （4）培养的细菌被杂菌污染。解决方法：重新挑取单菌落培养细菌。 5.抽提的质粒 DNA 电泳时怎么出现基因
质粒浓度。 4. 提取质粒超螺旋比例太低 通常来说，超螺旋被认为是一种能够最有效地提高转染效率和目的基因表达量的质粒形态。如果提取质粒的超螺旋比例太低，可以从以下几个方面考虑优化： ①裂解缓冲液添加后，切勿裂解太长时间，不要超过 5 min； ②添加中和缓冲液后操作轻柔，切勿剧烈震荡，否则会导致超螺旋结构断裂为开环或线性形式； ③使用合适的菌株来扩增质粒，比如 endA–菌株； ④挑选多个单菌落进行小量质粒抽提检测，挑选超螺旋比例高的单菌落来扩繁摇菌抽提质粒; ⑤另外，超螺旋的比例还跟质粒
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