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1
- 英文名：
pGMLV-FLAG-SV40T-PURO Lentivirus
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6个月
- 供应商：
上海再康
- 保存条件：
4℃保存
对于贴壁生长的pGMLV-FLAG-SV40T-PURO Lentivirus，相对来说比较简单但很麻烦。以下我主要讨论贴壁生长的pGMLV-FLAG-SV40T-PURO Lentivirus。
在讨论之前，大家首先要有一个概念，即洁净区，并不是没有细菌，而是细菌的数量非常少，国家标准100级的洁净标准是浮游菌数不得超过5个每立方米，沉降菌数不得超过1个每培养皿.而国外的标准比我国的还要高一点，要求的数量更少。
所以在我们的洁净操作台里，并不是真正一个细菌都没有的，所以在操作的时候还是要尽量利索迅速地完成操作。尽量减少进入培养体系细菌的数量。
处理方法如下：
1）.将污染的pGMLV-FLAG-SV40T-PURO Lentivirus培养液倒掉，转烧瓶口，加入10mlPBS，适当晃动清洗培养瓶，然后倒掉。转烧瓶口。
2）.继续加入10mlPBS，同样方法晃动，清洗培养瓶，然后倒掉。
3）.继续加入5mlPBS，同样方法洗瓶，主要是培养面，然后倒掉。
4）.重复步骤3再洗。
5）.重复步骤3再洗。
6）.加入3-5ml双抗，洗瓶，静置3-5分钟，然后吸出。
7）.加入3ml双抗，洗瓶，静置3-5分钟，然后吸出。
8）.再加入5mlPBS洗瓶，然后吸出。
9）.加入10ml培养液，加入2ml双抗，将换好新的培养液pGMLV-FLAG-SV40T-PURO Lentivirus放置培养箱培养，5小时之后，倒掉培养基，加入PBS洗瓶两次，然后加入胰酶消化，吹打后置于离心机800-1000r/min离心，然后洗一次。置于新的培养瓶里培养，培养体系加入2ml双抗。
10）.24h之后，视情况换液，若仍然污染严重，培养基浑浊，重复以上步骤，若看不到污染物，则继续步骤1)、3）、4）、6）、8），然后加入培养液培养pGMLV-FLAG-SV40T-PURO Lentivirus，培养体系加入2ml双抗.
11).24h之后，若仍污染严重，可再重复一次，若还污染只能弃之（不过一般没有出现这种情况），若镜下不见污染物，则换液PBS洗瓶，正常培养。
以上是对于细菌污染（常见为金 黄 色 葡 萄 球 菌和大肠杆菌）；若为霉菌或者真菌污染，加入两性霉素B清洗和培养，终浓度一般为2.5μg/ml（在30μg/ml时会有细胞毒性）。另外也可以选择在pGMLV-FLAG-SV40T-PURO Lentivirus培养基里加3ug/ml的制霉菌素或放 线 菌 素D。其它操作同；预防为主！！所以处理细菌污染的重要原则就是：无限地稀释细菌的浓度，无限地减少细菌的数量！尤其注意血清的质量！这个是主要来源。一般建议用北美血清。
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以上方法主要是针对贴壁生长的pGMLV-FLAG-SV40T-PURO Lentivirus，在操作的过程中，一定要小心操作动作，轻柔缓慢，切忌大动作鲁莽。防止pGMLV-FLAG-SV40T-PURO Lentivirus脱落。
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文献和实验From Lentiviruses to Lentivirus Vectors
Although a member of the lentivirus group, the equine infectious anemia virus (EIAV) was the first nonplant virus discovered in the first decade of the 20th century (1 ), lentiviruses were considered as rather mysterious viruses
Lentivirus vectors are promising tools for gene transfer (1 ,2 ). Retroviral vectors in general offer the unique advantage of stably integrating into the genome of the host cell, thus providing the basis for sustained gene expression
1 转染前一天将293T细胞铺于10cm板，当细胞密度达到80％左右即可进行PEI转染。 2将下列DNA加入一个已装有480ul 1* HBS( PH 7.4)灭菌管混匀 三质粒系统： 12ug vector 6ug VSVG 9ug PHR 四质粒系统： 12ug vector 6ug VSVG 6ug RSV-REV 6ug pMDL
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