过表达稳定细胞株构建

     技术简介

     基因过表达稳转株是指将目的基因转入目的细胞内长期且稳定地过量表达，其在基因功能研究、疾病模型的构建、药物筛选、蛋白质生产以及基因治疗等多个领域有着广泛的应用，纽万生物致力于为客户提供高质量的稳转细胞系构建服务，结合多年细胞生物学经验，建立了一套成熟稳定的基因过表达实验体系，结合转座子介导的基因整合系统，提供优质的基因过表达细胞构建服务。

      转座子，又称“跳跃基因”，是存在于生物基因组中的可移动遗传元件。转座子系统由两部分组成：包含外源基因的转座子载体和表达转座酶的辅助载体。当两者共同导入细胞后，转座酶会识别转座子两端的末端反向重复序列，并将目的基因从载体上精确切割下来，整合到基因组中。

     与慢病毒系统相比，转座子系统不需要包装病毒，实验周期缩短一半，且生物安全性更高。

 

 构建流程

四步实现稳定细胞株，构建转座子介导的过表达稳定细胞株需要经过一系列标准化流程。

(1)      载体设计是第一步。将目的基因克隆至转座子载体中，两侧为转座酶识别序列——末端反向重复序列。

(2)      根据需求选择适当的启动子，如组成型启动子或可诱导型启动子。

(3)      细胞转染是关键步骤。将重组转座子载体与转座酶表达载体按一定比例混合，共同转染目标细胞。

(4)      常用的转染方法包括电转和脂质体转染。

(5)      筛选富集是获得稳定细胞株的必要过程。转染48小时后，加入适当的筛选药物（如嘌呤霉素）进行压力筛选。

(6)      持续筛选约一周，直至未转染的对照组细胞全部死亡。

(7)      单克隆筛选与验证确保细胞株的纯度和质量。使用有限稀释法分离单细胞克隆，扩大培养后通过Western blot、流式细胞术等方法检测外源基因表达水平。

(8)      流式细胞术分析显示，经过上述流程获得的稳定细胞株，其GFP阳性率可达95%以上。

 

技术优势

转座子系统在稳定细胞株构建中展现出多重优势。它避免了传统质粒随机整合的低效率和不稳定性，也克服了病毒系统的安全风险和制备复杂性。

整合机制优越：转座子介导的整合是酶促反应，效率远高于普通质粒的随机整合。

承载容量大：转座子系统可容纳大片段DNA插入，甚至能够实现上百Kb的BAC片段的完整整合，这对于大基因或复杂表达元件的操作尤为重要。

基因表达稳定：由于转座子介导的是稳定基因组整合，外源基因能够在无持续抗生素压力下长期稳定表达。实验证明，经过9代以上传代，细胞仍能保持强烈的目的蛋白表达。

安全性高：与慢病毒系统不同，转座子系统不需要病毒包装，降低了插入突变风险，也减少了生物安全限制。